1果胶酶酶活力测定方法

1果胶酶酶活力测定方法

果胶酶降解底物的糖苷键，生成含还原端基产物，故采用常用的还原糖测定法—DNS 法。

1.1 测定原理

果胶酶在一定条件下水解底物果胶，生成半乳糖醛酸等醛糖，醛糖与3,5—二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540 nm 下测其吸光度，从而计算出果胶酶酶活。

·酶活性单位定义：在上述测定条件下，以每分钟水解底物生成1 μg 还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位，单位为U/mL。

1.2 DNS 试剂

用400 mL 蒸馏水溶解6.3 g 3,5-二硝基水杨酸，逐步加入21 g 氢氧化钠，再加入185 g 四水合酒石酸钾钠(C4H4O6KNa-4H2O)、5.0 g 苯酚、5.0 g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48 ℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。用蒸馏水定容至1000 mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5~7 d 后使用，贮存期为6 个月。

1.3 pH 7.0 的磷酸—柠檬酸缓冲溶液

参见《现代生化技术》，取Na2HPO4·12H2O 71.62g、C6H8O7·H2O 21.01 g，分别定容到1000 mL，按

16.47:3.53 的体积比混合，即可。

1.4 底物的配制

称取1.00 g 果胶，用pH 7.0 的缓冲溶液溶解，于磁力搅拌器上恒速搅拌0.5 h，用缓冲溶液定容至100 mL。存放在0~4 ℃冰箱里。

1.5 粗酶液的制备

取发酵液，于10000 r/min，4 ℃离心5 min 后，取上清液即为酶液。

2酶学性质分析

2.1 酶的最适温度

在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，pH 7.0的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。

2.2 酶的最适pH

在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（pH≤8.0的用磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH>8.0 的用甘氨酸

-氢氧化钠缓冲液），最适温度的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。

2.3 酶的温度稳定性

在适的pH 条件下，将酶液放置在不同的温度（55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）下，隔约15 min，在其最适温度和最适pH 条件下，测定其酶活，以起始条件下的酶活为100%，其他的以它的百分比计。

2.4 酶的pH 稳定性

分别用不同pH 缓冲液（pH3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0），在25 ℃下处理酶液4 h 后，然后调到最适pH，在其最适温度和最适pH 条件下，测定其酶活，考察果胶酶的pH 稳定性。以酶活最高者为100%。

3 结果及分析

3.1 酶的最适温度

在pH 7.0 的0.2 mol/L Na2HPO4-0.l mol/L 柠檬酸缓冲体系中，酶液在不同温度下进行酶促反应。结果

见图2，果胶酶的最适反应温度范围为55~65 ℃，最适温度为60 ℃。

3.2 酶的最适pH

pH 对菌株产果胶酶酶活的影响曲线如图4 所示，可以看出pH 8.0~9.0 是酶的最适pH 范围，在pH 8.5 时候酶活达到最高值。

3.3 热稳定性

将粗酶液分别置于55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的恒温水浴中，每隔一定的时间取样测定果胶酶活力。如图6 所示：果胶酶在55 ℃保温过程中，发现在保温30 min 时，酶活有略为上升，酶活力是原来的120%，这可能是在保温的过程中助于酶活构象的展开，更易酶反应的进行；在60 ℃保温的过程中，在保温15 min的时候也有酶活上升的现象，之后酶活开始下降，在120 min 后，残余酶活力是原来的89%；在60 ℃保温的过程中，酶活缓慢下降，在120 min 后，残余酶活力为酶活力为原来的61%；在70 ℃保温的过程中，在保温

20 min 过程中，果胶酶活迅速下降，残余酶活力降至原来的47%，之后缓慢下降，在120 min 时，残余酶活力降至原来的29%。

3.4 pH 稳定性

分别用不同pH缓冲液（pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0），在25 ℃下处理酶液4h后，然后调到最适pH，在其最适温度和最适pH条件下，测定其酶活，考察果胶酶的pH 稳定性。由图8，发现果胶酶在pH 3.0~10.0时有很好的稳定性, 在pH 3.0~10.0的范围内能保持酶活的90%以上。

4 结论

果胶酶的酶学性质是：最适温度为60 ℃，最适pH 是8.5，在60 ℃以下具有较好的热稳定性，在pH 3.0~pH 10.0 时有很好的稳定性，酸碱对其酶活的影响不是很大。