1果胶酶酶活力测定方法
果胶酶应用基理及活性检验方法
果胶酶应用基理及活性检测办法-1-23 16:57:21随着人们对健康环保纺织品需求增长以及各国政府对环保强制力度加大,在纺织印染行业中一种新型纺织助剂———生物酶制剂应用逐渐发展起来。
当前,一种基于果胶酶新型纺织生物助剂正在应用推广中,它重要用于棉、麻前解决工艺。
由于纺织公司多数对果胶酶生物特性不甚理解,在工艺应用过程中缺少相应检测手段,使其推广受到限制。
酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量重要指标,因而,建立合用于纺织行业果胶酶酶活检测办法,是十分迫切和必要。
2果胶酶酶促作用机理果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质各种酶总称。
咱们测定酶活值普通是这一类复合酶协同作用综合成果。
果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。
解聚酶重要是通过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。
果胶酯酶作用是使果胶分子中甲酯水解,最后形成果胶酸。
果胶质重要是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成直链状聚合物。
某些Ｄ-半乳糖醛酸上羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一种或各种碱某些或所有中和。
果胶质在植物细胞组织中起着“粘合”作用,在棉纤维初生胞壁中,果胶质含量约占9%,而麻纤维则更高。
通过果胶酶作用,将果胶质降解为小分子物质,从纤维中游离出来,可使与其粘合在一起其他杂质(如蜡质、蛋白质、灰份等)与纤维素彻底分开,达到棉精炼或麻脱胶目。
对于纺织行业,需要是将果胶催化水解成可游离出纤维、小分子物质果胶酶活性(力),因而,重要测定解聚酶活力。
解聚酶对果胶分子酶促催化作用体现为,每切断一种果胶分子α-1,4糖苷键,就会形成一种还原性醛基。
通过测定这些还原性醛基生成量,即可鉴定解聚酶酶活力。
3测定酶活力(性)基本原理酶作为一种生物催化剂,其酶活力值是与其催化效率及有效(即有生物活性)酶含量有关。
酶活力是酶在单位时间内将底物转化为反映产物能力,以Ｕ(ｍｏｌ/时间)表达,底物即是酶催化反映物。
高二生物 酶活力的测定
开 关
(1)酶活力单位是指在一定条件下，1min 内能转化 1μmol 底
物的酶量。测定过程中温度保持在 25 ℃，其他条件如pH 和
底物浓度等均应采用最适条件。
(2)测定方法
①一是测定完成一定量反应所需的时间，所需时间越短，说 明酶活力 越高 ；反之，酶活力 越低 。
学习探究区
第6课时
②二是测定在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速
学习探究区
第6课时
2．果胶酶可以将果胶水解成 β半乳糖醛酸，而半乳糖醛酸具有
还原性糖醛基，可用次碘酸钠法定量测量，其原理如下：碘
本 在碱性溶液中可以生成具有强氧化性的次碘酸盐，次碘酸盐
课 栏
能与醛糖反应，从而使醛糖氧化成糖酸盐。
目 开
RCHO＋I2＋3NaOH→RCOONa＋2NaI＋2H2O
关 醛糖
(2)为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装
在不同的试管中恒温处理？
本 答案 将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保
课
栏 证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混
目
开 合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。
关
(3)该实验的自变量是 温度 ，根据单一变量原则，应确保各实
表示在温度为 a 的情况下生成物量与时间的关系图。则当温
度增加一倍时生成物量与时间的关系是
(B )
本 课 栏 目 开 关
A．曲线 1 B．曲线 2 C．曲线 3 D．曲线 4
解析 从图一可以看出，当温度由 a 变为 2a 时，酶促反应 速率提高，所以能在更短的时间内达到图二中的饱和值。
学习探究区
本 课 栏 目 开 关
果胶酶的固定化及其活力测定
正文果胶酶的固定化及其活力测定一、目的：果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。
在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。
果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。
果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。
固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。
通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。
二、原理：本实验固定化方法为共价结合法。
以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。
壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。
三、试剂及仪器仪器：冷冻离心机分光光光度计比色皿（8只）摇床水浴箱混合振荡器天平瓷盘药匙剪刀(1把) 记号笔（1支）通风橱吸水纸具塞刻度试管（4支）三角瓶（2支）烧杯（100ml×3个）试管架（1个）试管（6支）量筒（100ml×1个）滴管（16个）离心管(5ml×2个,50ml×1个)移液管架(1个) 移液管(2ml×3个,5ml×1个) 注射器（1支）滴管(1个)吸耳球（1个）洗瓶（1个）玻棒（1个）烧杯(300 ml×5个)试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0）磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5－二硝基水杨酸氢氧化钠冰醋酸丙三醇戊二醛无水乙醇浓盐酸果胶酶果胶半乳糖醛酸壳聚糖蒸馏水若干桶四、方法步骤1 载体的制备1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。
实验报告果胶酶
一、实验目的1. 了解果胶酶的提取方法；2. 掌握果胶酶活性的测定方法；3. 探究不同提取方法对果胶酶活性的影响。
二、实验原理果胶酶是一种复合酶，主要由果胶分解酶、果胶酯酶和半乳糖醛酸酶组成。
它能够分解植物细胞壁中的果胶，使植物组织变得柔软，便于提取。
本实验通过提取黑曲霉等真菌中的果胶酶，并测定其活性，以了解果胶酶的特性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 黑曲霉菌种- 柑橘皮- 硫酸铵- 乙酸乙酯- 氯化钠- 碳酸氢钠- 磷酸氢二钠- 磷酸二氢钠- 果胶- 水浴锅- pH计- 离心机- 移液器- 烧杯- 试管- 滴定管- 酶标板- 酶标仪2. 实验试剂：- 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）- 果胶酶提取液- 果胶溶液- 氯化钠溶液- 碳酸氢钠溶液- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液四、实验方法1. 果胶酶提取（1）将黑曲霉菌种接种于装有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的培养皿中，培养48小时。
（2）将培养好的黑曲霉菌种接种于装有马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，培养48小时。
（3）将培养好的菌液以4,000 r/min离心10分钟，收集菌体。
（4）将菌体用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。
（5）将洗涤后的菌体加入硫酸铵溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。
（6）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。
（7）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。
（8）将洗涤后的沉淀加入乙酸乙酯溶液中，搅拌溶解，去除蛋白质。
（9）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。
（10）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。
（11）将洗涤后的沉淀加入氯化钠溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。
（12）将溶液以4,000 r/min离心10分钟，收集沉淀。
（13）将沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除杂质。
（14）将洗涤后的沉淀加入碳酸氢钠溶液中，搅拌溶解，调节pH至7.0。
分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究
分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称，它可分为内切型和外切型两大类。
果胶酶广泛应用于果品的加工工业中，主要作用是果品榨汁时降低果浆泥的粘稠度，提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和稳定性等。
果胶酶的活力对果品的加工品质影响很大，因此测定果胶酶的活力显得尤为重要。
测定酶活力的方法主要有还原法、色原底物法、粘度法等，其中还原法中的3，5一二硝基水杨酸比色法(简称DNS法)具有操作简便，对试剂、仪器等条件要求不高等优点。
该方法是利用果胶酶在一定温度、时间和条件下水解果胶，释放出还原性D一半乳糖醛酸，与3，5一二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，即发生显色反应。
在一定范围内，水解生成D一半乳糖醛酸的量与吸光度成正比，与果胶酶活力成正比，通过分光光度计测定吸光度，可以计算出果胶酶的活力。
该方法(又称分光光度计法)简单易行，但操作中影响因素较多，往往影响测定结果的准确性。
本研究就测定中各影响因素进行了优化实验，试图提出果胶酶活力测定的最佳技术参数。
1 材料与方法1．1 材料与仪器乙酸钠(CH3 C00Na·3H2O)、冰乙酸(CH3C00H)、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠(C 4H4KNaO6.4H2O)、苯酚以上试剂均为市售分析纯；3，5一二硝基水杨酸国药集团化学试剂有限公司；D一半乳糖醛酸97％，沃凯化学试剂有限公司；果胶、果胶酶天津利华酶制剂厂生产；实验用水均为去离子水。
TU一1810紫外分光光度计北京普析；电热恒温水浴锅上海宝磊。
1．2 实验方法1．2．1 试剂配制1．2．1．1 乙酸一乙酸钠缓冲溶液(pH4．8) 首先制备0．2mol／L 的乙酸溶液和0．2mol ／L 的乙酸钠溶液，然后将0．2mol／L 乙酸溶液410．0mL 与0．2mol／L 乙酸钠溶液59 0．0mL混合均匀，用酸度计测定。
1．2．1．2 DNS试剂(3g／L) 称取3．00g 3，5一二硝基水杨酸，溶解于500mL蒸馏水中，再逐步加入10．4gNaOH、9l、0g C4H4KNaO6.4H2O、2．5g苯酚和2．5g无水亚硫酸钠，温水浴(不超过4 8oC)中不断搅拌，直至溶液清澈透明。
果胶裂解酶活力测定方法
果胶裂解酶活力测定方法1定义在测定条件下，每分钟作用果胶产生1µmol双键所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。
2 原理果胶裂解酶作用果胶产生不饱合寡聚半乳糖醛酸。
反应产物分子中C－4和C－5之间有一与C－5上羧基相连的双键，使之在235nm波长有最大吸收。
分子消光系数为5500cm2 /mmol。
3 试剂3.1 琥珀酸钠（C4H4O4Na2·6H2O） 3.3 浓盐酸（HCL）3.2 琥珀酸（C4H6O4） 3.4 果胶（Sigma公司，P9135）本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。
4 仪器和设备4.1 实验室常用仪器设备。
4.6 秒表（数字显示）4.2 恒温水浴：（30±0.5℃）。
4.7 分析天平（0.0001g）4.3 分光光度计（波长范围200-1000nm） 4.8 磁力搅拌器。
4.4 移液管 4.9 离心机：转速为30000r/min 以上。
4.5 酸度计：精确至小数点后2位。
5 溶液5.1 0.05mol/L，pH=5.2琥珀酸缓冲液称取琥珀酸钠（C4H4O4Na2）13.51g于900ml水中，溶解后用琥珀酸（C4H6O4）调pH值至5.2，定容至1000ml，校正pH值后置冰箱中备用。
5.2 2mol/L盐酸准确量取16.7ml浓盐酸，用水定容至100ml。
5.3 0.425%果胶溶液（底物）称取0.425g果胶于80ml缓冲液中，至少搅拌3h，溶解后于4℃放置16h，30000rpm/min 离心30min，用缓冲液定容至100ml, 4℃保存。
6 分析步骤：6.1待测酶液的制备6.1.1 根据酶活力确定稀释倍数，使酶浓度控制在大约 0.06-0.09u/mL,即光吸收值在0.25—0.40范围内。
6.1.2 称取酶粉1g，精确至0.0001g，（或吸取酶液1.00 ml）。
用蒸馏水溶解，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，全部移入容量瓶中，稀释倍数小于500倍的直接用缓冲液(5.2)溶解。
果胶酶活力测定
果胶酶的应用： 果胶酶的应用
果汁生产中存在的问题： 果汁生产中存在的问题： （1）果肉出汁率低，耗时长 ）果肉出汁率低， （2）榨取的果汁浑浊、黏度高、容易沉淀 ）榨取的果汁浑浊、黏度高、
在适宜条件下，果胶酶能使果汁中的不溶性果胶溶解， 在适宜条件下，果胶酶能使果汁中的不溶性果胶溶解， 可溶性果胶的黏度下降，使果汁易于澄清和过滤。 可溶性果胶的黏度下降，使果汁易于澄清和过滤。这不仅能 使果汁易于压榨，而且还能提高出汁率。 使果汁易于压榨，而且还能提高出汁率。
果胶酶的活力测定及应用
教师： 教师：余子全 研究生：王静芳 刘霜 研究生：
果胶： 果胶： 1.果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，由半乳 果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一， 果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一 糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。不溶于乙醇 这是鉴别果胶的 糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。不溶于乙醇,这是鉴别果胶的 组成 一种简易方法。 一种简易方法。 2.果胶可结合大量的水分，降低植物组织的分散性，因此起着 果胶可结合大量的水分，降低植物组织的分散性， 果胶可结合大量的水分 将植物细胞粘合在一起的作用，是很好的凝固剂， 将植物细胞粘合在一起的作用，是很好的凝固剂，用煮沸的 凝固剂 山楂泥可制成山楂糕，就是利用果胶的作用。 山楂泥可制成山楂糕，就是利用果胶的作用。 3.在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。 在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率 还会使果汁浑浊 出汁率， 浑浊。 在果汁加工中
实验材料： 三.实验材料 实验材料
(1) 1%果胶溶液：称量 果胶溶液： 果胶粉， 果胶溶液 称量0.1 g果胶粉，加热水溶解，煮沸，冷却后过滤，定 果胶粉 加热水溶解，煮沸，冷却后过滤， 容至10 容至 ml (2) 配制 配制0.1mol／L柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液 柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液 ／ 柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液(pH＝3.5) 甲液 称取柠檬酸 ＝ 1.05g,用水溶解并定容至 用水溶解并定容至50mL；乙液称取柠檬酸三钠 用水溶解并定容至 ；乙液称取柠檬酸三钠1.47g ,用水溶解并定容 用水溶解并定容 甲乙两液以7： 的比例混匀 的比例混匀, 至50mL ；甲乙两液以 ：3的比例混匀 调pH至3. 5 至 (3) 0.1 mol/L碘溶液：称量碘化钾 g，溶于 ml水中，另取碘 碘溶液： 水中， 碘溶液 称量碘化钾1 ，溶于0.8 水中 另取碘0.508 g 溶 于碘化钾溶液中，待全部溶化后定容至 于碘化钾溶液中，待全部溶化后定容至40ml
【高中生物】高中生物知识点：酶的制备和活力的测定
【高中生物】高中生物知识点：酶的制备和活力的测定酶的制备和活力的测定：酶活力（enzymeactivity）：也称为酶活性，是指酶在催化一定的化学反应时表现出来的能力，通常用酶促反应的速率即酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力的高低会受温度、pH、激活剂等多种因素的影响。
酶的提取一般选择在低温和适合的pH下进行，有时还要加入酶的激活剂以提高酶活力。
例如，从植物材料中提取果胶酶就是在低温、偏酸性的提取液和NaCl作激活剂的条件下进行的。
一、制备果胶酶1、实验材料和器具：新鲜的水果或蔬菜；质量分数为10%的NaCl溶液，0.1mol/L冰醋酸；研钵，剪刀，漏斗，纱布或滤纸，烧杯，精密pH试纸，试管，酒精灯，离心机，榨汁机等。
2、果胶酶的制备：（1）将50g新鲜的水果或蔬菜洗净，在预冷的研钵内用剪刀迅速剪碎后研磨，边研磨边加入质量分数为10%NaCl溶液50mL，制成匀浆。
（2）漏斗中放置滤纸或5层纱布过滤匀浆液，收集滤液。
（3）以4000r/min的离心速率离心滤液15min。
注意使用同一规格的离心管，离心管内滤液的高度不超过离心管长度的2/3，离心前要确保在离心机中对称放置的离心管（内含滤液）的质量相等。
（4）离心完毕后，果胶酶主要存在于离心管的上清液中，迅速地将上清液倒入洁净的小烧杯内，用0.1mol/L冰醋酸将pH调至3～4，在0～4℃下保存备用。
二、观察果胶酶对苹果匀浆液的作用1、用榨汁机制作苹果匀浆液，将匀浆液置于90℃的恒温水浴中保温4min。
冷却后再过滤，收集滤液。
2、取两支试管，编号为1和2，分别加入30mL滤液，再向试管1中加入30mL保存备用的上清液，向试管2中加入经过90℃水浴保温4min后的上清液30mL，振荡摇匀两支试管，置于室温下。
3、观察两支试管中苹果匀浆液的澄清程度变化，并将结果记录在下表中。
项目苹果匀浆液/mL上清液/mL90℃水浴保温4min后的上清液/mL现象澄清时间试管1 （样品管）3030试管2 （对照管）3030知识点拨：注意事项：在温度、pH影响酶活性的实验中，始终都贯穿着对照原则，而在设置对照实验时最重要的是运用单一变量原则，其中的变量就是我们所研究的对象，所以在分析实验问题时，要紧紧抓住研究变量，把其他可能影响实验结果的变量变为常量，才能保证对照实验结果的严密性和准确性。
检测果胶酶活性
酶(enzyme)是在生物体活细胞中合成的。多数酶在细 胞内直接参与生物化学反应，少数的酶要分泌到细胞 外发挥作用。
2．酶是怎样提取出来的？
如果提取存在于细胞内的酶，需要破碎生物组织细胞，可 用破碎仪、研磨器或匀浆器等机械将组织细胞破碎，使酶 从活细胞中释放出来，进入细胞外的溶液中，经过滤、离 心制备成粗酶液。对于唾液淀粉酶、胰蛋白酶等分泌到细 胞外的酶，可以直接从动物分泌物或细胞外的组织间隙中 提取。
3．酶的活性是指什么?
是指酶催化一定化学反应的能力。
4.酶活性的高低一般用什么指标表示？
其高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反 应的反应速度来表示。 酶反应速度：用单位时间内、单位体积中反应物的减 少量或产物的增加量来表示。
5.影响酶活性的主要因素有哪些?
温度、pH和酶的抑制剂等条件都会影响酶的活性．
③根据你对酶的特性的了解，画出实验结果的可能坐标曲线．
巩固练习及作业
１.果胶酶常在0-4℃下 保存。其原因是 C Ａ．此温度条件下，酶的活性最高。 Ｂ．此温度条件下，酶变性失活。 Ｃ．低温可降低酶的活性，但酶不变性失活。 Ｄ.自然条件下，果胶酶常在0-4℃下发生催化作用。
２．关于果胶及果胶酶的叙述中，正确的是 B Ａ．果胶酶不溶于乙醇。 Ｂ．果胶不溶于乙醇。 Ｃ．加热使果胶变性失活。 Ｄ．加热使果胶酶活性增强。
３. 为研究温度对果胶酶活性的影响．某学生设计了如下实验： ①将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在10℃水浴中恒温处理 10分钟（如图A）。
②将步骤①处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10℃水浴中 恒温处理10分钟（如图B）。 ③将步骤②处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量（如 图C）。 ：
果胶酶测定方法
果胶酶测定方法“哎呀，这水果怎么这么难弄啊！”我看着手中的水果，不禁发起了牢骚。
“怎么啦？”妈妈笑着走过来，“这就不耐烦啦？”“可不是嘛，我想做点果酱，这果胶也太难处理了。
”我无奈地摇摇头。
“哈哈，那你可就不知道了吧，有一种东西叫果胶酶，可以帮你解决这个问题哦。
”妈妈神秘地说道。
果胶酶测定方法其实并不复杂。
首先呢，要准备好需要的材料和试剂，比如标准果胶溶液、DNS 试剂、缓冲液等等。
然后就是具体的步骤啦，先取适量的酶液，加入到含有果胶的反应体系中，在一定温度下保温一段时间。
接下来，加入 DNS 试剂终止反应，再通过沸水浴显色。
最后呢，用分光光度计测定吸光度，就可以计算出果胶酶的活性啦。
这里面可有不少注意事项呢！比如说，在操作过程中要严格控制温度和时间，不然结果可就不准确啦。
还有啊，试剂的用量也要精确，可不能马虎哦。
那果胶酶有啥应用场景和优势呢？这你可就问对啦！果胶酶在食品工业中可是大有用处呢，像制作果汁、果酱、果酒这些，都能让产品的口感更好，品质更优。
而且它还能提高生产效率，降低成本，多好呀！我就给你讲个实际案例吧。
之前我们隔壁的叔叔家开了个小果酱厂，一开始他们做出来的果酱总是不够细腻，口感也不太好。
后来他们了解到果胶酶，就试着在生产过程中使用，哇，效果简直太明显啦！做出来的果酱那叫一个细腻顺滑，销量都大增了呢。
“哇，听起来好厉害啊！”我不禁感叹道。
“是呀，所以说科技的力量是很强大的。
”妈妈笑着说。
我在心里暗暗想，以后我也要好好研究这些东西，说不定我也能做出超棒的食品呢。
想想看，要是没有这些科学的测定方法和应用，我们的生活该少了多少乐趣和便利呀。
就像我们吃的那些美味的食品，如果没有果胶酶这样的好帮手，可能就没有那么美味啦。
这就好像是一场奇妙的化学反应，把各种元素组合在一起，就产生了意想不到的效果。
所以说呀，我们可不能小看这些小小的酶，它们可是有着大大的能量呢！我现在对果胶酶测定方法充满了好奇和探索的欲望，我要赶紧去试试，看看我能不能也成为一个小小的“果胶酶专家”。
高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件
高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件果胶酶是一种特殊的水解酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中。
其主要功能是分解果胶，促进果实软化，增加果汁浓度和流动性。
果胶酶的活性检测及分析一直是食品工业、饮料业和制药工业中非常重要的研究领域之一。
其中高速液相色谱法是一种快速、简便、准确，且能解决高分子物质分析问题的一种方法。
本文旨在探讨高速液相色谱法测定果胶酶活性的优化条件。
一、色谱柱的选择根据需求选择适当的色谱柱是高速液相色谱法测定果胶酶活性的第一步。
一般可选用聚合物或硅胶固定相的色谱柱，常见的是树脂交联聚合物色谱柱。
这种色谱柱具有较高的稳定性和抗溶液性，使得它能够在不同的实验条件下保持稳定性和准确性。
同时，聚合物色谱柱的多孔性能也保证了准确的分离和纯化果胶酶的效果。
二、流动相的配置高速液相色谱法需要在某些严格的条件下进行，如选择合适的流动相是非常关键的一步。
在测定果胶酶活性时，可以使用一些简单的有机酸盐类溶液作为流动相。
以磷酸二氢钾缓冲液和甲酸铵溶液（pH值为3.5）为例。
三、pH值的控制果胶酶比较适合在酸性条件下进行测定，因此需要严格控制流动相的pH值。
在进行实验前，应首先确定合理的流动相pH值范围。
通常采用pH值为3.5的磷酸二氢钾缓冲液和甲酸铵溶液进行测定。
当然，不同类型的果胶酶可能对不同的pH值有不同的适应性，因此需要根据实际情况进行合理的调整。
四、温度的影响温度是高速液相色谱法测定果胶酶活性的另一个重要参数，直接影响到果胶酶的活性。
一般情况下，室温（20-25℃）下进行实验即可，但需要根据实际情况进行调整。
如在低温（暴冷）下进行实验时，果胶酶的活性会下降，需要将流动相加温以提高温度。
五、测定数据的处理高速液相色谱法测定果胶酶活性后，需要对数据进行处理和分析。
通过对数据的统计和分析，可以得到果胶酶的活性值和一些相关的技术参数。
处理数据时需要注意对数据进行初步筛选和选择，确保获得的结果符合实际情况，同时需要对数据的精度和可靠性进行检查。
果胶酶活性的检测
果胶酶活性的检测目的本检测方法是用来确定本公司果胶酶的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体果胶酶制剂。
说明本方法适合于果胶酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。
果胶包括两种酸性多糖（聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸）和三种中性多糖（阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖）。
果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。
果胶酶活力单位定义1g(或1ml液体酶)酶粉,于50.0℃、pH3.5条件下,每分钟催化果胶水解生成1微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位。
1.试剂和仪器*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯1.1醋酸1.2碘1.3碘花钾1.4浓硫酸1.5果胶（sigma公司）1.6硫代硫酸钠1.7碳酸钠1.8可溶性淀粉1.9水浴锅1.10碘量瓶2.试剂的制备2.1 pH3.5的酸水用醋酸将蒸馏水调至3.52.2 1%果胶溶液：准确称取分析纯果胶1g，用酸水溶解煮沸，冷却后过滤，定至100ml。
2.2 0.1N碘液：准确称取碘化钾5g，用蒸馏水溶解后，加入2.54g碘，溶解后定容至100ml。
2.3 0.025mol/L硫代硫酸钠：准确称取6.2g硫代硫酸钠，加蒸馏水后定容至1L2.4 0.5%可溶性淀粉指示剂：准确称取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。
2.5 1M碳酸钠溶液：准确称取10.6g碳酸钠，定容于100ml的水中2.6 2N硫酸：吸10ml的浓硫酸倒入170ml的水中2.7酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，定容至100ml，于50℃水浴浸取1小时，过滤，滤液为供试酶液。
则该酶已经稀释100倍。
3.程序3.1取1%果胶酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸馏水（PH3.5），在50℃水浴中保温反应1小时。
分光光度法测定果胶酶活性方法的研究
分光光度法测定果胶酶活性方法的研究目的：通过研究和探索高效液相色谱法测定果胶酶活性方法，获取更为准确、快速的方法，以推广应用。
方法：用果胶酶、淀粉酶、明胶、双蒸水为原料，以高效液相色谱法测定果胶酶活性，并且对测定的结果进行了对比，考察其准确度、精密度及线性范围等性能，同时对结果进行分析。
结果：通过测定最佳工艺条件下不同原料得到果胶酶溶液、葡萄糖浓度及酸碱度，实验结果证明，在pH值5.0、 50 mM葡萄糖、 0.5%NaOH及300 nM酶液的情况下，酶液完全被分解，但是在60 mM葡萄糖浓度下无法使酶完全水解，通过调整葡萄糖浓度，降低酸碱度，可以满足最终测定要求。
结果与分析：测定结果显示：测定条件不同，测得的果胶酶活性值差异较大，这主要由于各种果胶酶在pH值、葡萄糖浓度及酸碱度上存在着差异所致。
为了减小测定条件的影响，必须选择最佳条件，根据测定结果，在不同条件下，果胶酶活性与酶液pH值呈一定的负相关，而与葡萄糖浓度呈正相关，这与生物分子中的疏基和酯基具有亲水性的特点相吻合。
另外，酶活性的升高随着葡萄糖浓度的增加也呈增加趋势，这是因为果胶酶活性对pH值和葡萄糖浓度非常敏感，当温度适宜时，果胶酶才会活跃起来，这是由于多种果胶酶均在低温下稳定，当温度上升时，果胶酶变为高活性状态，这个特点决定了酶活性的动态变化。
结论：在酸性条件下用酶液浸泡过滤后得到的滤液中活性最大，随着酶液浓度的增加，果胶酶活性也相应增加，但随着浓度的增加酶液的稳定性会逐渐降低。
果胶酶活性与酶液pH值存在着一定的相关性，这与前人的研究结果相符合，如，潘永萍等采用高效液相色谱法测定了果胶酶在不同浓度（ 0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 16、 20、24、 28、 32、 40、 44、 48、 64、 80、 88、 96、 100、 128、128、 128、 128、 128、 128、 128、 128、 128、 128、 128）下的活性，实验结果表明，在pH为5.0时，测得的活性最高。
果胶酶活性测定实验报告
一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。
（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。
（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基:果胶1% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。
（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。
果胶酶活性测定实验报告
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
半乳糖醛酸（mg）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
缓冲液（ml）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
DNS (ml)
3
3
3
3
3
3
3
定容总体积(ml)
20
20
20
20
20
20
20
OD（540nm）
（3）、酶活的测定
操作步骤
（3）、UV2000型分光光度计的使用注意事项
提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；
将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；
调节测定所用波长；
读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30％酒精中。
2、实验总结
实验菌种的采集不成功，没有到要求的地方采集，也可能是温度较低不适宜菌体生长；菌种分离纯化时可能是无菌操作不严格，导致平板上面杂菌滋生，没有分离出目的菌种，各方面的操作都有不严谨之处，最后得到的酶活性较低，实验做的不是很成功。
（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。
（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
2、果胶酶的酶活测定方法
（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
1果胶酶酶活力测定方法
1果胶酶酶活力测定方法果胶酶降解底物的糖苷键，生成含还原端基产物，故采用常用的还原糖测定法—DNS 法。
1.1 测定原理果胶酶在一定条件下水解底物果胶，生成半乳糖醛酸等醛糖，醛糖与3,5—二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540 nm 下测其吸光度，从而计算出果胶酶酶活。
·酶活性单位定义：在上述测定条件下，以每分钟水解底物生成1 μg 还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位，单位为U/mL。
1.2 DNS 试剂用400 mL 蒸馏水溶解6.3 g 3,5-二硝基水杨酸，逐步加入21 g 氢氧化钠，再加入185 g 四水合酒石酸钾钠(C4H4O6KNa-4H2O)、5.0 g 苯酚、5.0 g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48 ℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。
用蒸馏水定容至1000 mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5~7 d 后使用，贮存期为6 个月。
1.3 pH 7.0 的磷酸—柠檬酸缓冲溶液参见《现代生化技术》，取Na2HPO4·12H2O 71.62g、C6H8O7·H2O 21.01 g，分别定容到1000 mL，按16.47:3.53 的体积比混合，即可。
1.4 底物的配制称取1.00 g 果胶，用pH 7.0 的缓冲溶液溶解，于磁力搅拌器上恒速搅拌0.5 h，用缓冲溶液定容至100 mL。
存放在0~4 ℃冰箱里。
1.5 粗酶液的制备取发酵液，于10000 r/min，4 ℃离心5 min 后，取上清液即为酶液。
2酶学性质分析2.1 酶的最适温度在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，pH 7.0的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。
以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。
2.2 酶的最适pH在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（pH≤8.0的用磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH>8.0 的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），最适温度的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。
番茄中果胶酶活力的测定
实验三番茄中果胶酶活力的测定一、实验原理番茄中的果胶酶系相当复杂，它主要包括聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酯酶（PE）两类。
聚半乳糖醛酸酶能催化果胶降解，导致果胶溶液粘度下降。
因此，可通过测定酶催化反应体系粘度下降的速度来测定它的活力，果胶酯酶能催化果胶分子中半乳糖醛酸单位上的酯键水解，产生游离的羧基和甲醇，导致果胶溶液的pH下降，因此可以用pH—stat法测定它的活力。
二、试剂和仪器试剂：20%氯化钠溶液、0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.5（Ⅰ）、1%果胶溶液pH4.5、0.5mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.5（Ⅱ）、1mol/L 氯化钠溶液、0.1mol/L 氢氧化钠溶液（准确标定）、0.05mol/L 氢氧化钠溶液仪器：组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、秒表、常规玻璃仪器、奥氏粘度计、pH 计三、实验步骤1、酶液的制备300g番茄+ 100mL20%氯化钠溶液↓匀浆↓ 离心（4℃,10000rpm，20min）↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓沉淀上层清液↓ 抽滤，量取清液体积↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓沉淀酶液Ⅰ↓ 按516g硫酸铵/L酶液（80%的硫酸铵饱和度）缓慢加入研细的硫酸铵粉末↓ 离心（40℃,10000rpm，20min）↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓上层清液沉淀↓溶于约10mL0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液Ⅰ酶液Ⅱ↓在0.05mol/L醋酸缓冲液Ⅰ中透析（MWCO12000）透析物↓离心（40℃,10000rpm，20min）↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓沉淀部分纯化的果胶酶溶液2、PG活力的测定测定30℃下水的流动时间，3次平行之间相差应小于0.2秒。
果胶酶活力测定
果胶酶活力测定
原理：果胶是广泛存在于果蔬植物组织中的多糖物质。
果胶酶以果胶为底物,可以使果胶分解并产生半乳糖醛酸。
3, 5二硝基水杨酸(DNS)与醛糖共热能够产生棕红色氨基化合物,在一定范围内还原糖量与呈色物溶液颜色成正比,一定波长下,测定溶液吸光值可算出半乳糖醛酸含量,从而计算果胶酶酶活。
试剂：
DNS溶液：酒石酸钾钠182 g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，苯酚5 g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，室温保存.
D-半乳糖醛酸溶液(1mg/mL): 准确称取0.100g半乳糖醛酸于锥形瓶中，用pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到100mL。
方法：
标准曲线的绘制：
，放置20min,测定540nm波长下吸光度。
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1果胶酶酶活力测定方法
果胶酶降解底物的糖苷键，生成含还原端基产物，故采用常用的还原糖测定法—DNS 法。
1.1 测定原理
果胶酶在一定条件下水解底物果胶，生成半乳糖醛酸等醛糖，醛糖与3,5—二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物, 在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540 nm 下测其吸光度，从而计算出果胶酶酶活。
·酶活性单位定义：在上述测定条件下，以每分钟水解底物生成1 μg 还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位，单位为U/mL。
1.2 DNS 试剂
用400 mL 蒸馏水溶解6.3 g 3,5-二硝基水杨酸，逐步加入21 g 氢氧化钠，再加入185 g 四水合酒石酸钾钠(C4H4O6KNa-4H2O)、5.0 g 苯酚、5.0 g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48 ℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。
用蒸馏水定容至1000 mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5~7 d 后使用，贮存期为6 个月。
1.3 pH 7.0 的磷酸—柠檬酸缓冲溶液
参见《现代生化技术》，取Na2HPO4·12H2O 71.62g、C6H8O7·H2O 21.01 g，分别定容到1000 mL，按
16.47:3.53 的体积比混合，即可。
1.4 底物的配制
称取1.00 g 果胶，用pH 7.0 的缓冲溶液溶解，于磁力搅拌器上恒速搅拌0.5 h，用缓冲溶液定容至100 mL。
存放在0~4 ℃冰箱里。
1.5 粗酶液的制备
取发酵液，于10000 r/min，4 ℃离心5 min 后，取上清液即为酶液。
2酶学性质分析
2.1 酶的最适温度
在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，pH 7.0的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。
以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。
2.2 酶的最适pH
在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（pH≤8.0的用磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液，pH>8.0 的用甘氨酸
-氢氧化钠缓冲液），最适温度的条件下，反应30 min，测定果胶酶酶活。
以最大的酶活的活力为100%，其他的以它的百分比计。
2.3 酶的温度稳定性
在适的pH 条件下，将酶液放置在不同的温度（55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）下，隔约15 min，在其最适温度和最适pH 条件下，测定其酶活，以起始条件下的酶活为100%，其他的以它的百分比计。
2.4 酶的pH 稳定性
分别用不同pH 缓冲液（pH3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0），在25 ℃下处理酶液4 h 后，然后调到最适pH，在其最适温度和最适pH 条件下，测定其酶活，考察果胶酶的pH 稳定性。
以酶活最高者为100%。
3 结果及分析
3.1 酶的最适温度
在pH 7.0 的0.2 mol/L Na2HPO4-0.l mol/L 柠檬酸缓冲体系中，酶液在不同温度下进行酶促反应。
结果
见图2，果胶酶的最适反应温度范围为55~65 ℃，最适温度为60 ℃。
3.2 酶的最适pH
pH 对菌株产果胶酶酶活的影响曲线如图4 所示，可以看出pH 8.0~9.0 是酶的最适pH 范围，在pH 8.5 时候酶活达到最高值。
3.3 热稳定性
将粗酶液分别置于55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的恒温水浴中，每隔一定的时间取样测定果胶酶活力。
如图6 所示：果胶酶在55 ℃保温过程中，发现在保温30 min 时，酶活有略为上升，酶活力是原来的120%，这可能是在保温的过程中助于酶活构象的展开，更易酶反应的进行；在60 ℃保温的过程中，在保温15 min的时候也有酶活上升的现象，之后酶活开始下降，在120 min 后，残余酶活力是原来的89%；在60 ℃保温的过程中，酶活缓慢下降，在120 min 后，残余酶活力为酶活力为原来的61%；在70 ℃保温的过程中，在保温
20 min 过程中，果胶酶活迅速下降，残余酶活力降至原来的47%，之后缓慢下降，在120 min 时，残余酶活力降至原来的29%。
3.4 pH 稳定性
分别用不同pH缓冲液（pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0），在25 ℃下处理酶液4h后，然后调到最适pH，在其最适温度和最适pH条件下，测定其酶活，考察果胶酶的pH 稳定性。
由图8，发现果胶酶在pH 3.0~10.0时有很好的稳定性, 在pH 3.0~10.0的范围内能保持酶活的90%以上。
4 结论
果胶酶的酶学性质是：最适温度为60 ℃，最适pH 是8.5，在60 ℃以下具有较好的热稳定性，在pH 3.0~pH 10.0 时有很好的稳定性，酸碱对其酶活的影响不是很大。