PEG诱导鸡血细胞融合实验方法比较

文章编号：2096-0387 (2018) 02-0112-03

第4卷第2期 生物化工

Vol.4 No.22018 年 4 月

Biological Chemical Engineering

Apr. 2018

PEG 诱导鸡血细胞融合实验方法比较

黄伟伟，颜华，高梅，李绍军

(西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵712100)

摘要:细胞融合技术是细胞生物学的一项核心技术，在科学研究、医药开发、农业育种等方面有着广泛应用。PEG 法诱导

鸡血细胞融合实验也被作为细胞生物学本科实验的一项重要内容，但在实验课程中的融合效果不佳。笔者查阅相关细胞生物学 实验指导教材和文献，发现存在两种截然不同的PEG 法诱导鸡血细胞融合操作方法。因此，本文对两种方法进行了比较，并进一 步讨论了影响PEG 法诱导鸡血细胞融合效率的重要因素和改进方法。

关键词：细胞融合；PEG ;鸡血细胞；实验优化 中图分类号：Q813

文献标志码：A

Comparison of Two Experimental Methods of PEG Induced Chicken Blood Cell Fusion

Huang Wei-wei, Yan Hua, Gao Mei, Li Shao-jun

(College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Shaanxi Yangling 712100)

Abstract: Cell fusion is one of core technologies of cell biology, which has been widely applied in scientific research, medicine development, agricultural breeding and so on. Experiment of PEG induced chicken blood cell fusion is an important content of cell biology experimental course for undergraduate students, but the fusion effect in the experimental course is not good. The author consulted the relevant cell biology experimental guide textbooks and literature, and found that there are two different protocols for PEG induced chicken blood cell fusion. So in this paper, we compared these two operation methods, further discussed the important factors related with the cell fusion efficiency and give some advice for the operation method optimization.

Key words ： Cell fusion; PEG; Chicken blood cells; Experiment optimization

细胞融合（Cell fusion )是在自然条件下或人工 诱导条件下使两个或两个以上的细胞合并成为一个 双核或多核细胞的过程。1962年，日本科学家冈田

(Okada )首次在体夕卜利用仙台病毒（Sendai virus )诱

导细胞融合，开创了人工诱导细胞融合的先河[1]。此 后，细胞融合技术取得了快速发展。1975年，Kohler 和Milstein 首次报道了利用细胞融合技术将免疫的小 鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合P]，从而建立了 利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体技术,这是现代生物 学领域最重要的技术之一，对现代生命科学和医学等 领域产生了巨大影响。目前细胞融合技术已被应用 在科学研究、医药开发、农业育种等多个领域。

目前诱导细胞融合的方法主要有生物法、化学 法和物理法三种方式。生物法是利用一些病毒如仙 台病毒、副流感病毒等被膜上的融合蛋白诱导细胞融 合。化学法是利用化学试剂如聚乙二醇（PEG )，二 甲基亚砜（DMSO ),脂质体等改变细胞膜脂质分子 排列诱导细胞融合。物理法是利用物理手段如电激， 激光等引发细胞膜结构重排诱导细胞融合。化学法 以其成本低廉、设备要求低、可大规模诱导、没有种 属限制等优点，已成为人工诱导细胞融合的主要手段 '其中，P E G 法是使用最广的细胞融合方法。PEG 诱导法具有操作简单，融合效果相对较好，容易获得 融合体的优点，不仅在实验室经常使用，而且PE G 诱

作者简介:黄伟伟(1982—),男，陕西杨陵人，博士，讲师，研究方向：细胞生物学的教学与研究。

第2期黄伟伟等：PEG 诱导鸡血细胞融合实验方法比较

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导鸡血细胞融合实验是细胞生物学本科实验课程中 的一项重要内容。然而，在实际实验过程中，PEG 诱 导鸡血细胞融合效果不理想，需要进一步的优化改 进。笔者翻阅相关细胞生物学实验指导和文献发现 存在两种截然不同的PEG 法诱导鸡血细胞融合操作 方法[3_5],本文对两种方法进行了优劣比较，并进一步 讨论了影响PEG 法诱导鸡血细胞融合效率的重要因 素和改进方法，以资参考。

1实验方法1.1 方法 I [3]

(1)

从鸡颈静脉或者翼下静脉采血，并加入适 量抗凝血剂，按照1 : 4的比例加入Alserver 溶液， 混勻制成鸡血细胞悬液。

(2)

用离心管取鸡血细胞悬液1 mL ，加人4 mL 0.85%生理盐水,混匀后1 000 r /min 离心3 min ,弃上 清液，再重复洗涤一次。

(3)

加入5 mL Hanks 溶液重悬鸡血细胞，1

000 r /min 离心3 min ,弃上清液，按照细胞体积加入 适量Hanks 溶液，稀释成10%的细胞悬液，置于37 T 水浴中备用。

(4)

利用血球计数板对细胞悬液计数， 确定细胞密度；用Hanks 溶液将细胞密度调整到 3 x 107 ~ 4 x 107 个 /mL 。

(5 )用新离心管取1 mL 稀释的鸡血细胞悬液， 沿管壁加人0.5 mL 预热的50% PEG 溶液，边加边摇 晃离心管，再用吸管吹打混匀，放人37 ^C 7jC 浴中孵育 30min 〇

(6 )缓慢加入5 mL Hanks 溶液混匀，37 t 水 浴中再孵育5 min 。

(7 )混勻细胞，取少量细胞悬液滴加在载玻片 上，加人两滴0.1%詹那斯绿B 染液，用牙签混匀，染 色10 min ，盖上盖玻片，吸去多余液体，在显微镜下 观察细胞融合现象。

1.2方法丨丨[45]

(1) ~ (4)步骤中的采血和稀释与方法I (1) ~ (4)相同。

(5)

用新离心管取1 mL 稀释的鸡血细胞悬

液，加人5 mL Hanks 溶液,混匀后1 000 r /min 离心3

min ，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。

(6 )沿管壁加人1 mL 预热的50% PEG 溶液，边 加边轻轻摇晃离心管混勻，要求1 min 内滴加完，之后 再静置1 min 。此过程要求全部在37^水浴中进行。

(7 )缓慢滴加9 mL Hanks 溶液，37丈水浴中 孵育5min 〇

(8 )加人2滴0.1%詹那斯绿B 染液，37丈水 浴中孵育10 min ;染色后取少量细胞悬液滴加在载玻 片上，盖上盖玻片，吸去多余液体，在显微镜下观察 细胞融合现象。

2结果与讨论

在光学显微镜下观察细胞融合情况，通常可以 看到两个或者两个以上的鸡血细胞汇集在一起，注意

区分细胞融合与细胞重叠，区分的标准是观察细胞之

间的细胞膜是否消失融合，可以通过微调焦距进行判 断，发生融合的细胞的细胞膜融合在一起，从而形成

一个异体核细胞。除了观察判断细胞是否融合，还要统计细胞融 合率，判断诱导融合效果。细胞融合率是指在显微镜 的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内

所有细胞(包括已融合的细胞）的细胞核总数之比，

通常以百分比表示。通常选取3个独立视野,分别统 计视野中的细胞核总数和发生融合的细胞核数，然后 根据公式计算细胞融合率:融合率=融合的细胞核总 数/细胞核总数x 100%。

3两种方法差异比较

方法I 是将0.5 mL 50% PEG 溶液加人1 mL 鸡

血细胞悬液中，混合后的PEG 浓度约为16.7%，浓度 非常低，远未达到PEG 最佳融合浓度范围；而且诱 导持续30 min ,时间过长，长时间孵育会引起PEG 从 混合液中析出，漂浮在水溶液之上，造成溶液分层， 而鸡血细胞则由于重力作用沉降到离心管底部，导致 PEG 与鸡血细胞不能充分接触,而且沉降的鸡血细胞 易凝集成团。由于鸡血细胞悬液体积较多，PEG 溶 液较少，使得混合液中的pH 值不能达到PEG 诱导融 合所需的微碱环境，基于这些原因，导致方法I 的细

胞融合效率较低。方法II 是利用1 mL 50%PEG 溶液重悬离心沉淀