兔瘟组织灭活苗的制作

五、结果：
绘模式种、自 选种镜检油镜 视野图（比例 、形状准确， 注放大倍数， 染色特性）
G+ (金黄色葡萄球菌)
G-（枯草芽孢杆菌）
G-（大肠杆菌）
Gram Stain of Staphylococcus aureus
Gram Stain of Escherichia coli
A Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.
健康兔只有22～23，＜24。
RHD组织灭活苗的制造与检验
病料：PBS=1:10 ，生理盐水也可。 捣碎、滤过，加入甲醛，使之含0.4%， 37℃ 12—24小时，摇匀/2小时。
用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释，分装，37℃温 箱内灭活48小时，每2小时摇匀一次，备检。
方 法：
100g+400ml灭菌生理盐水——高 速组 织、捣碎碎机匀浆（13）——过滤——用 0.8%甲醛生理盐水对倍稀释——分装—— 37℃温箱内灭活24小时，每2小时摇匀一次， 备检。
细水冲洗 细水冲洗 结晶紫初染2min 碘液媒染1min
细水冲洗 蕃红复染 1~2min 95%酒精脱色 20s
革兰氏染色成败关键：
酒精脱色，脱色不够将G-转变为G+，脱 色过度将G+变成G-； 涂片要均匀、薄； 菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细菌培 养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色 用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小 时，以免影响染色性。
（1）抗生素可先配制成高浓度的原液， -20℃保存。 （2）抗生素的最高使用浓度。 青霉素钾1万单位/ml 链霉毒钾：20mg/ml即 1mg=1000Iu 2万Iu/ml。 抗生素的配置： 1先配浓溶液20万/ml，25万/ml
2、RHD的临床诊断及实验室诊断
临床上，RHD以神经症状为主，在免疫压力可 表现出非典型变化。 剖检以呼吸系统的严重出血和内脏实质器官的 淤血肿大为特征。 人工感染后的发病高峰时间 接种后36～72小 时。
外膜
肽聚糖 脂蛋白
染色操作步骤—涂片固定
干燥
取菌液一环 涂片 干燥
滴生理盐水
挑取菌苔一环
涂片
热固定
革兰氏染色法
1. 涂片、干燥及固定 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染 液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫 色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而 后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色 约25秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后 用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果图。
兔病的综合诊断
王海荣
流行病学诊断
临床诊断
被检材料
病理诊断
增菌培养
镜检 生化试验 （种属）
纯培养
动物试验
培养特性
血清学试验
活苗
药敏试验
灭活苗
微生物(Microorganism) 形体微小、结构简
单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观 察。 病毒(包括噬菌体)； →非细胞型微生物 细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣 →单细胞原核微生物 原体、螺旋体等； 真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多 →真核微生物 细胞）； 单细胞的藻类以及原生动物等。

油镜操作规程
1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到 视野中央。 2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。 3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切 记不能使用粗调，以免压碎载玻片。 4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方 向。 5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦 去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦1～2次，把大部分油去 掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。 擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细 心，动作要轻 。
一 材料
（1）种毒 强毒株组织毒1:10悬液感染成 兔肌注1ml，48～72小时引起发病死亡。 （2）制苗动物 3月龄以上未感染本病和未接种本病疫 苗的健康免。 ⑶ 组织捣碎机等
二、操作方法
1、攻毒 取种毒2-5g制成1:10组织悬液，每毫 升各加青链霉素1000IU单位,在4℃处理4～ 6小时，取上清液皮下或肌肉注射兔子， 1ml/只，实验免接毒后的观察。
细菌(bacteria)的细胞形态Baidu Nhomakorabea
1、球菌
单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其 接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态， 可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、 链球菌、葡萄球菌。
2、杆菌
细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径 比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似 球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其 粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条 件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯， 有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半 圆。
细胞壁 厚度与强度 肽聚糖数量、含量 脂类含量 磷壁酸（垣酸）
革兰氏阳性菌 (G+) 厚、致密、坚韧 多层、含量高、占细胞 干重40—90% 少、占细胞干重1-4% +
革兰氏阴性菌 (G-) 薄、疏松 单层、含量低、占细胞 干重5—10% 多、占细胞干重11-22% -
脂多糖、磷脂、脂蛋白
-
+
磷壁酸
（三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用 至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。 染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发 生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细 胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙 醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态， 细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精 将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成 红色。
检验：
①安全检验：2—3倍接种量 1ml—3ml(血液琼脂斜面，厌氧肉肝汤) ②无菌检验：培养基接种。 ③效力检验：
③ 效力检验：
试验： 对照：7——10天产生免疫力→攻毒。对 照免三分之二或100%死亡。 保护率应>80%
4、免疫期测定 5、疫菌的保存 4℃ 25℃ 保存6个月
七 思考题
1 兔瘟的病变有哪些？ 2 如何制备兔瘟组织灭活苗？
兔病毒性出血症的诊断及其组织 灭活苗的制造
王海荣
兔的病毒性出血症（rabbit viral hemorrhagic diseaze）是兔的一种急性败 血性传染病，RHDV抗原性强，组织灭活苗 效果极佳，安全可靠，目前广泛使用的是 肝组织甲醛灭活苗，联苗兔瘟、巴氏杆菌 二联苗也已使用。
组织灭活苗可分加佐剂和不加佐剂两种。含佐 剂苗所产生的抗体水平较高于无佐剂苗，但产生 免疫力的时间迟于无佐剂苗，而且生产程序较为 复杂，成本也高。 当发生免瘟时，作为紧急接种，选用无佐剂苗 更为理想，因产生免疫力较快，可提早控制疫情， 即使平时预防接种，无佐剂苗也极为有效。
RHDV可凝集人的O型红细胞，温度对血 凝无显著影响，PH4.4-7.2时血凝稳定，血 凝具有特异性，能被高免血清所抑制。
10%肝悬液4000rpm，10-15分钟离心后取上清， 1%人O型红细胞做HA，放置20-30分钟出结果， 血凝现象的观察时间不超过45分钟。 HA≥1︰160即为阳性 阳性病料无论是自然死亡 还是人工感染致死，其血凝价一般不低于25。