病毒培养技术课件

•组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅等 材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状，上面 有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质和 代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有滞 留作用。
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悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸附在表面，如DEAE—SephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、 Cytodex3等。
• 尿囊腔接种法 • 卵黄囊接种法 • 羊膜腔接种法 • 静脉接种法 • 脑内接种法
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鸡胚绒毛尿囊膜接种法
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尿囊腔接种法
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尿囊液收获方法
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鸡胚卵黄囊接种法
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（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。
能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均 类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系
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2．细胞培养方法
• 静置培养 • 转瓶培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) •微载体培养(microcarrier cell culture) • 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
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血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
• 血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。
• 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活 30min ， 并 进 行 细 胞 毒 性 试 验 。 生 长 液 血 清 含 量 一 般 为 5 ％～20％。维持液中血清量为0%～5％。
微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细 胞产量达106～107个/m1，每升培养液可加微载体2Baidu Nhomakorabea5g，每 克有8000～9000个珠子，培养面积约为2～5万cm2，比常规 培养面积大10～25倍。
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中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture)
• 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因
子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、
聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清
培养液须补加3～8种血清学替习交代流P因PT 子。
⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
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二、禽胚增殖病毒技术
（一）禽胚的选择
• SPF鸡胚
据国家标准，无22种特定病原体
• 非免疫鸡胚
应无特定病原的母源抗体，
• 普通鸡胚
可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产
异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚
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（二）禽胚接种途径与收获
• 绒毛尿囊膜接种法
量最高，平均约6～8ml，羊水约1～2ml。 •接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 •严格防止禽胚污染
①鸡胚接种时严格无菌操作； ②定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； ③种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。
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三、细胞增殖病毒技术
1．细胞培养的概念
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。
②母源抗体：
③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
2．孵化技术
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。
③通风：氧气，二氧化碳。
④翻蛋：
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3．接种技术
不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 •接种日龄：鸡胚13～14日龄。鸭胚15～16日龄，尿囊液含
细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
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（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero
（3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高度
活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度可
达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。
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3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量
•pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
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RPMI-1640、199、 DMEM、F12
病毒增殖技术
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动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
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一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)；
②对相应病毒易感，并十分敏感；
③经隔离饲养和观察检查证明健康；
④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并 符合普通级实验动物标准；