多糖类药物的分析

类似于呋喃，称之为呋喃糖。
环化单糖中氧化数最高的碳称为异头碳。在环式结构 中，异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两 种异头构型中的一种，即-或-构型。
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葡萄糖环状结构
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椅式构象

β-D-葡萄糖
α-D-葡萄糖
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直链淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷键结合成的链状化合物

CH2OH O O OH
右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是最早发现的微生物 多糖，也是世界上第一个工业化的微生物多糖。右旋糖酐 是蔗糖经肠膜状明串珠菌产生的右旋糖酐蔗糖酶催化后生 成的高分子葡萄糖聚合物。右旋糖酐注射液可作为抗血栓 药（抗血小板）降低血液黏性，在贫血症方面用于扩增血 容量。 细菌荚膜多糖的临床应用多为疫苗，其对肺炎和流行性脑 膜炎的预防效果十分显著。该多糖一般以2～5种单糖连接 形成的糖链为重复单位，在长链状多糖结构的主链上常常 带有支链。

粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值 （ η ＝ K M2），然后测出待测多糖的特 性粘数η ，计算待测多糖的分子量。

超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖 的平均分子量。
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高效液相色谱法测定分子量及分布

色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间 待测多糖分子量（GPC专用软件）： 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中 被洗脱物质的量（重量）。

（一）超离心法: 单一区带 （二）电泳法： 单一色带 （三）凝胶色谱法： 单一洗脱峰 （四）旋光法： 均一组分
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第三节 多糖的分子量测定


凝胶色谱法 粘度法 高效液相色谱 电泳法 质谱法
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凝胶层析法


凝胶层析法：将分子量不同 的蛋白质通过一定孔径的凝 胶固定相，由于各组分流经 体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离。 最先淋出的是最大的分子。 Kd = 0， Ve= V0 ； Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ； 0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi 。
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质谱法
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质 量与所带电荷比（m/z)的差异来分离并确定相对分子质量，是 目前测定相对分子质量最精确的方法。 电喷雾离子化（electro spray ionization，ESI）技术 基质辅助激光解析电离（matrix-assisted laser desorption ionization） 飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOFMS） 傅里叶变换质谱（fourier transform mass spectrometry， FTMS）
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电泳法

随着电泳技术的发展，高效毛细管电泳（ HPCE）越来越多地应用于多糖类化合物的 分离分析中，此法所需样品量小、分析速 度较快且可同时分析多个样品。对于带有 电荷的多糖可直接进行电泳分析，而不带 电荷的多糖也可通过酸性荧光标记试剂衍 生后进行电泳分析。将待测样品与已知分 子量的一系列标准品的电泳结果进行比对 ，可得出待测样品的分子量。
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凝胶色谱法




方法： Sephadex G-200，多糖标准品 分部收集，硫酸 - 苯酚检测，分别求得洗 脱体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关 系，绘制标准曲线。 Ve=-KlogM+C 将待测样品上柱，待测多糖Ve。 通过标准曲线求出待测多糖分子量。
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粘度法、超离心法
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硫酸咔唑法测糖含量

硫酸咔唑法—己糖醛酸测定 在浓硫酸中，己糖醛酸与咔 唑溶液反应生成的反应物呈 红色。 520nm比色


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硫酸苯酚法测定糖含量（总 糖）

原理：多糖在浓硫酸作 用下水解成单糖，该单 糖在强酸性条件下，与 苯酚反应生成橙色衍生 物。 它在490nm处有最大吸 收，其吸光度与浓度呈 线性关系。

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生物测定法——肝素测定方法

标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、 低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成 三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。 供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价 （AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、 低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。 各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反 应平行线测定法计算效价及实验误差。 可信限率（FL%）不得大于5%。
3

4
组成分类：



均一多糖 不均一多糖 粘多糖：含氮的不均一多糖 结合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白 (glycoproteins)和蛋白聚糖 糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage) 将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分 为β-构型的N-糖苷键和α-构型的O-糖苷键.
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色谱条件与系统适用性试验 用强阴离子交换硅胶为填充剂（如Hypersil SAX柱，250 mm 4.6 mm，5 μm），以水为流动相A，以2 mol/L氯化 钠溶液（为流动相B；流速1.0 ml/min，检测波长232 nm。组分流出顺 序为硫酸软骨素B、硫酸软骨素C和硫酸软骨素A，三者色谱峰的分离度 均应符合要求。 含量测定法 取待测品约0.1 g，精密称定后置10 ml容量瓶中加水溶解并 稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，精密量取100 μl，置具塞试管 中，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液800 μl，充分混匀，再加入硫酸软骨素 ABC酶液100 μl，摇匀，置于37℃水浴中反应1 h，取出，100℃加热5 min，用冷水冷却。离心（10000 rpm）20 min后分取上清液，以0.45 μm滤膜滤过，精密量取20 μl注入色谱仪，记录色谱图。另取硫酸软骨 素钠对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以硫酸软骨素A、硫 酸软骨素B与硫酸软骨素C的峰面积之和计算，即得。
多糖类药物的分析
一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析
1
第一节 概述:
肝素 硫酸软骨素
多糖的分类----来源
黄芪多糖 枸杞多糖
动物
活性多糖
植物
微生物
香菇多糖 灵芝多糖 右旋糖苷
海洋生物
海洋真菌多糖 螺旋藻多糖
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微生物来源


细菌产生的典型胞外多糖有：右旋糖酐、果聚糖 及荚膜多糖等。
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（一）多糖组成单糖的分析



1、水解方法 （1）、完全酸水解法 （2）、部分酸水解、碱水解 （3）、乙酰解 （4）、甲醇解 （5）、酶降解 2、鉴定
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（1）、完全酸水解法

水解难易取决单糖性质及构型。 呋喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易 水解，α型较β型易水解。 已聚糖一般用1 mol/L硫酸， 70℃，8小时。 氨基葡聚糖为4 mol/L盐酸， 100℃ 9小时。
连接键构型
一种
一种
二肽与双糖
2个相同氨基酸连接形成的二肽仅1种
Ala
Ala
2个相同单糖连接形成的双糖有11种
Glc-Glc α型 β型 1-1连接 三种海藻糖 （α-α，α-β， β-β） 1-2连接 曲二糖 槐糖 1-3连接 黑曲二糖 昆布二糖 1-4连接 麦芽糖 纤维二糖 1-6连接 异麦芽糖 龙胆二糖
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O- （N-）糖苷键型糖蛋白
O-糖苷键 N-糖苷键
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磷酸乙醇胺残基
磷脂酰肌醇-聚糖的糖 蛋白
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蛋白聚糖

软骨蛋白聚 糖:聚集体的分
子量非常大（大 约为2×108）， 其中含有透明质 酸、硫酸角质素、 硫酸软骨素、连 接蛋白、核心蛋 白和大量的寡糖 链。
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多糖组成-单糖
吡喃 呋喃
六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖
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第四节、多糖的含量测定

比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、 硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠） 生色底物法（低分子量肝素钠） 高效液相法（硫酸软骨素）
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乙酰丙酮法（elson-morgan）
——氨基己糖

原理： 氨基己糖在碱性条件下 加热，可与乙酰丙酮缩 合成吡咯衍生物，该衍 生物与对－二甲氨基苯 甲醛反应，反应物呈红 色，于 525nm 测定吸 收度。
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蒽酮法测定糖含量（总糖）

原理：多糖在浓硫酸中 水解后，进一步脱水生 产糠醛类衍生物，与蒽 酮作用形成蓝色化合物， 620nm进行比色测定。


特点：10-100μg范围 内其颜色的深浅与糖含 量成正比。 灵敏度高。
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生物测定法－肝素测定

美国药典采用羊血浆法。 即比较肝素标准品和供 试品延长血浆凝结时间 的作用来测定肝素的效 价。



常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物
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二、糖苷键连接方式的测定


红外光谱——糖苷键类型
确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在8Baidu Nhomakorabea0cm-1 处有特征吸收者，示有β-型糖苷键，在840cm-1 处有特征吸收者，示有α-型糖苷键。
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生色底物法原理－肝素、低分子肝素

当蛋白酶（FⅩa）从 生色底物分裂出pNA时， 发色物的产生量与剩余 的酶量成正比，与肝素 效价成反比。


405 nm测定。
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生色底物



Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰； 对-硝基苯胺（pNA）。 酰胺分解法（amidolytic method）。 当蛋白酶从生色底物分裂出 pNA时，发色物的产 生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 405 nm测定。 32
5


糖蛋白有三种主要类型

糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖 苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。 在大多数的O-糖苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为 GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与 一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。
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第五节、多糖类药物的结构分析

单糖组成 糖苷键连接方式 糖苷键连接位置
DNA 蛋白质
天然20种氨基酸
多糖
200多种单糖，常见20余种 每种单糖存在异构体 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6糖苷键 存在α、β两种构型 36
基本单元
4种核苷酸
连接键
3’-5’磷酸二酯键
N-C肽键

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（5）、酶降解

分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。 外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个 单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要 求。 内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释 放多糖链片断以利于结构分析。
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2、单糖的分离鉴定

气相色谱法
高效液相色谱法
气相色谱法与质谱分 析连用
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气相色谱法
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（2）、部分酸水解、碱水解 选择温和的条件水解多糖，使糖链中某 种类型的键特异性地打断。

（3）、乙酰解 多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸） 可生成乙酰化单糖和寡糖
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（4）、甲醇解

多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反 应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。 甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙 酰基衍生物，进行气相色谱分析。
CH2OH O OH OH O
CH2OH O OH OH O
CH2OH 直链淀粉 O OH OH O
O OH
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纤维素
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多糖的理化性质



旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm） 硫酸苯酚反应(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm) 糖醛酸——硫酸咔唑(520nm)
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第二节 多糖的纯度测定
生色底物法

抗Xa因子活性测定

以溶液吸收度和浓度的 对数，照生物检定统计 法中量反应平行线测定 法计算出供试品的抗 Xa 因子活性
可 信 限 率 (FL%) 不 得 大于10%。
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高效液相色谱法





糖类化合物一般缺乏特征的紫外吸收，为提高其在高 效液相色谱检测中的灵敏度，常常采用衍生的方法使 其成为具有紫外或荧光吸收的衍生物，再进行检测。 包括柱前衍生-HPLC 荧光标记-HPLC 柱后衍生-HPLC 直接HPLC和离子交换色谱法 如2015版《中国药典》中，采用离子交换色谱法对硫 酸软骨素进行含量测定，并以外标法计算待测样品含 量。