细胞毒理学

细胞毒理学及其研究方法

公共卫生学院劳动卫生教研室金亚平

定义:

毒理学(Toxicology)是研究外源性物质对生命有机体损伤作用规律及其机制的一门学科。

细胞毒理学(Cytotoxicology):

是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科。

研究内容

细胞毒理学是以培养细胞为研究对象进行毒理学研究的一门科学，它主要是应用体外模型对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行监测，评价其对人体可能产生的危害。

研究有害因子的一般毒性作用

判断外源性有害因子对细胞的一般毒性及评价可能引起的潜在毒性作用。

可通过光学显微镜/电镜及其他方法，直接观察体外培养细胞受损的性质与程度，如细胞的形态学改变、贴壁性差、生长速度减弱、细胞退化、死亡及完整性受损等。

已知对人类有毒性作用的大多数药物或毒物，在体内与体外的毒性效应是一致的。

研究有害因子的特异毒性作用

从哺乳动物或人体的不同组织器官分离出不同类型的细胞。用以筛检不同毒物对不同细胞的毒性。有害因子诱变作用及致癌作用: 体外培养细胞，特别是哺乳动物的离体细胞已广泛应用于体外测试诱变和致癌的试验中，其包括基因点突变、染色体畸变、姊妹染色单体互换、染色体显带、DNA 损伤、程序外DNA合成和细胞恶性转化等。如砷的致癌作用。

研究有害因子在细胞内的代谢

体外培养细胞可能是研究毒物代谢最合适的体外试验模型。体外细胞培养避免了体内复杂因素(如神经-内分泌、营养物质等)的干扰，可以按研究者预先设计的需要，来严格控制有害因子的剂量及与细胞接触的时间。可以直接检测、分析细胞内代谢的改变，容易了解毒物代谢与毒性之间的量-效关系。如砷体内代谢等。

研究有害因子的毒作用机制

也是研究有害因子毒性作用机制的最合适的材料。如用已建立的体外细胞转化系统研究辐射及化学致癌物诱发细胞癌变的机制，用血管上皮细胞和星形胶质细胞的体外培养系统研究毒物对血脑屏障的损伤，用巨噬细胞和成纤维细胞组成的体外培养系统，研究二氧化硅致矽肺纤维发生、发展过程及其作用机制。

用于药物的筛选、进行药效学评价

可用于研究药物的作用、毒副反应及其作用机制，为选择疗效好、毒副反应小的药物提供资料，在此研究基础上，对疗效好、毒性小的初筛药物，再用动物实验模型加以验证。

细胞毒理学发展简史

细胞毒理学作为毒理学的一个分支学科出现是近10多年的事。因此，它是一门较新的学科。

其优点:

(1) 可以按实验要求控制实验条件，把整个实验安排在体外进行，在体外直接观察到细胞形态发生的改变，便于了解毒物与毒性作用之间的关系。

(2) 实验条件易于控制，可严格控制作用物的剂量和作用时间，排除体内复杂的神经-内分泌因素的干扰，实验结果稳定，重复性好。

(3) 操作简便，不需要复杂的大型仪器设备，实验经济。

(4) 可同时提供大量的生物学性状相同的细胞系(株)作为研究对象，避免了动物间的个体差异，实验易重复。

局限性：

因为细胞是在离开机体整体环境下，独立生长在体外环境中，其生物学性状多少会发生某些改变，

所获得的结果可能与人体或动物体的整体实验结果存在某些差异。因此，细胞毒理学实验结果存在着由体外实验结果推论体内实验结果的问题。

细胞毒理学研究的实验条件

无菌间：

(1) 超净工作台：应有照明和紫外线消毒装置。

(2) CO2培养箱：维持恒定的5％CO2浓度，温度在37.0±0.5℃。

(3) 紫外线灯：无菌间天花板上应安装1-2个紫外线灯，每天操作前30min进行空气消毒。

(4) 空调器：尤其在炎热的夏季。

倒置显微镜：用于活体培养细胞观察，最好有显微摄像装置，可对活体细胞进行拍摄。

普通显微镜：用于细胞计数，固定标本的检测。

显微摄像：可对培养细胞的生长、分裂或对作用物的反应情况进行动态拍摄观察。

高压蒸气消毒器

在体外细胞培养过程中所需的许多物品和液体都需要高压蒸汽消毒。消毒所需的压力和时间，根据不同消毒对象而异。

消毒条件：

玻璃器皿为15磅压力(121 ℃)，15min；

液体溶液为10磅压力(115 ℃)，10min。

冰箱、冰柜

各种培养用的液体、试剂、药品溶液、血清都需要冷藏，一般常用已配好的培养液可在4℃冰箱或冰柜保存；血清、胰蛋白酶等需要保存在-20℃或更低温度的冰箱内；某些特殊用途的生化试剂，如各种工具酶等则需保存在低温(-80℃)冰箱内。

过滤器

由滤器、滤膜组成。滤膜是除茵的主要材料，一般孔径为0.22µm，去除细菌，但对于小于0.2µm 的支原体或小于0.1µm的病毒无去除作用。过滤除茵操作应在无菌间超净台内进行。

微量滤器

当滤过的溶液较少时，可选用微量薄膜滤器，其结构与蔡氏滤器一样，小间夹着一层纤维素酯薄膜，以0.22µm的薄膜除菌效果最好。

培养瓶、培养皿和培养板

有玻璃材料或塑料材料制成。用玻璃培养瓶或皿比较经济，可反复清洗使用。

玻璃器皿的清洗

新玻璃器皿：先用清水冲洗，再浸入洗衣粉或洗洁精水溶液中煮沸半小时。然后用毛刷刷洗，流水冲至肥皂沫除尽为让。瓶壁上沾有肥皂液会影响细胞贴壁生长，即使1:100万的肥皂痕迹也会有影响。清水冲洗干净后、浸入清洁液中过夜。取出，流水冲洗，冲洗时用力震摇，最后用蒸馏水冲洗2-3次，烘干。

使用过的玻璃器皿

用后立即浸入清水中，防止蛋白质粘附于瓶、皿壁表面难以洗脱，然后浸入洗洁精水溶液中，用毛刷刷洗，其余清洗步骤同上。浸泡于清洁液中是玻璃器皿清洗过程中关键的一步。要求将整个器皿完全浸入清洁液中，不要有气泡。

清洁液：用浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配制而成，有很强的氧化作用，去污效果十分好。

塑料器皿的清洗

由于塑料器皿耐腐蚀性不强，且质地较软，其清洗方法与玻璃器皿有所不同。不能用清洁液浸泡。常规清洗方法：用清水浸泡24h，再用2％NaOH溶液浸泡过夜。取出、清水冲洗后，用5％稀盐酸溶液浸泡30min，蒸馏水冲洗或蒸馏水浸泡24h后，取出，冲洗、凉干、备用。

金属器材的清洗