细胞毒理学

细胞毒理学及其研究方法公共卫生学院劳动卫生教研室金亚平定义:毒理学(Toxicology)是研究外源性物质对生命有机体损伤作用规律及其机制的一门学科。

细胞毒理学(Cytotoxicology):是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科。

研究内容细胞毒理学是以培养细胞为研究对象进行毒理学研究的一门科学，它主要是应用体外模型对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行监测，评价其对人体可能产生的危害。

研究有害因子的一般毒性作用判断外源性有害因子对细胞的一般毒性及评价可能引起的潜在毒性作用。

可通过光学显微镜/电镜及其他方法，直接观察体外培养细胞受损的性质与程度，如细胞的形态学改变、贴壁性差、生长速度减弱、细胞退化、死亡及完整性受损等。

已知对人类有毒性作用的大多数药物或毒物，在体内与体外的毒性效应是一致的。

研究有害因子的特异毒性作用从哺乳动物或人体的不同组织器官分离出不同类型的细胞。

用以筛检不同毒物对不同细胞的毒性。

有害因子诱变作用及致癌作用: 体外培养细胞，特别是哺乳动物的离体细胞已广泛应用于体外测试诱变和致癌的试验中，其包括基因点突变、染色体畸变、姊妹染色单体互换、染色体显带、DNA 损伤、程序外DNA合成和细胞恶性转化等。

如砷的致癌作用。

研究有害因子在细胞内的代谢体外培养细胞可能是研究毒物代谢最合适的体外试验模型。

体外细胞培养避免了体内复杂因素(如神经-内分泌、营养物质等)的干扰，可以按研究者预先设计的需要，来严格控制有害因子的剂量及与细胞接触的时间。

可以直接检测、分析细胞内代谢的改变，容易了解毒物代谢与毒性之间的量-效关系。

如砷体内代谢等。

研究有害因子的毒作用机制也是研究有害因子毒性作用机制的最合适的材料。

如用已建立的体外细胞转化系统研究辐射及化学致癌物诱发细胞癌变的机制，用血管上皮细胞和星形胶质细胞的体外培养系统研究毒物对血脑屏障的损伤，用巨噬细胞和成纤维细胞组成的体外培养系统，研究二氧化硅致矽肺纤维发生、发展过程及其作用机制。

用于药物的筛选、进行药效学评价可用于研究药物的作用、毒副反应及其作用机制，为选择疗效好、毒副反应小的药物提供资料，在此研究基础上，对疗效好、毒性小的初筛药物，再用动物实验模型加以验证。

细胞毒理学发展简史细胞毒理学作为毒理学的一个分支学科出现是近10多年的事。

因此，它是一门较新的学科。

其优点:(1) 可以按实验要求控制实验条件，把整个实验安排在体外进行，在体外直接观察到细胞形态发生的改变，便于了解毒物与毒性作用之间的关系。

(2) 实验条件易于控制，可严格控制作用物的剂量和作用时间，排除体内复杂的神经-内分泌因素的干扰，实验结果稳定，重复性好。

(3) 操作简便，不需要复杂的大型仪器设备，实验经济。

(4) 可同时提供大量的生物学性状相同的细胞系(株)作为研究对象，避免了动物间的个体差异，实验易重复。

局限性：因为细胞是在离开机体整体环境下，独立生长在体外环境中，其生物学性状多少会发生某些改变，所获得的结果可能与人体或动物体的整体实验结果存在某些差异。

因此，细胞毒理学实验结果存在着由体外实验结果推论体内实验结果的问题。

细胞毒理学研究的实验条件无菌间：(1) 超净工作台：应有照明和紫外线消毒装置。

(2) CO2培养箱：维持恒定的5％CO2浓度，温度在37.0±0.5℃。

(3) 紫外线灯：无菌间天花板上应安装1-2个紫外线灯，每天操作前30min进行空气消毒。

(4) 空调器：尤其在炎热的夏季。

倒置显微镜：用于活体培养细胞观察，最好有显微摄像装置，可对活体细胞进行拍摄。

普通显微镜：用于细胞计数，固定标本的检测。

显微摄像：可对培养细胞的生长、分裂或对作用物的反应情况进行动态拍摄观察。

高压蒸气消毒器在体外细胞培养过程中所需的许多物品和液体都需要高压蒸汽消毒。

消毒所需的压力和时间，根据不同消毒对象而异。

消毒条件：玻璃器皿为15磅压力(121 ℃)，15min；液体溶液为10磅压力(115 ℃)，10min。

冰箱、冰柜各种培养用的液体、试剂、药品溶液、血清都需要冷藏，一般常用已配好的培养液可在4℃冰箱或冰柜保存；血清、胰蛋白酶等需要保存在-20℃或更低温度的冰箱内；某些特殊用途的生化试剂，如各种工具酶等则需保存在低温(-80℃)冰箱内。

过滤器由滤器、滤膜组成。

滤膜是除茵的主要材料，一般孔径为0.22µm，去除细菌，但对于小于0.2µm 的支原体或小于0.1µm的病毒无去除作用。

过滤除茵操作应在无菌间超净台内进行。

微量滤器当滤过的溶液较少时，可选用微量薄膜滤器，其结构与蔡氏滤器一样，小间夹着一层纤维素酯薄膜，以0.22µm的薄膜除菌效果最好。

培养瓶、培养皿和培养板有玻璃材料或塑料材料制成。

用玻璃培养瓶或皿比较经济，可反复清洗使用。

玻璃器皿的清洗新玻璃器皿：先用清水冲洗，再浸入洗衣粉或洗洁精水溶液中煮沸半小时。

然后用毛刷刷洗，流水冲至肥皂沫除尽为让。

瓶壁上沾有肥皂液会影响细胞贴壁生长，即使1:100万的肥皂痕迹也会有影响。

清水冲洗干净后、浸入清洁液中过夜。

取出，流水冲洗，冲洗时用力震摇，最后用蒸馏水冲洗2-3次，烘干。

使用过的玻璃器皿用后立即浸入清水中，防止蛋白质粘附于瓶、皿壁表面难以洗脱，然后浸入洗洁精水溶液中，用毛刷刷洗，其余清洗步骤同上。

浸泡于清洁液中是玻璃器皿清洗过程中关键的一步。

要求将整个器皿完全浸入清洁液中，不要有气泡。

清洁液：用浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配制而成，有很强的氧化作用，去污效果十分好。

塑料器皿的清洗由于塑料器皿耐腐蚀性不强，且质地较软，其清洗方法与玻璃器皿有所不同。

不能用清洁液浸泡。

常规清洗方法：用清水浸泡24h，再用2％NaOH溶液浸泡过夜。

取出、清水冲洗后，用5％稀盐酸溶液浸泡30min，蒸馏水冲洗或蒸馏水浸泡24h后，取出，冲洗、凉干、备用。

金属器材的清洗新金属器材表面常涂有防锈油，因此，在清洗前，须先用纱布蘸汽油擦去防锈油。

再用洗洁精水溶液刷洗，流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次，晾干、消毒备用。

使用过的金属器材先用清水冲洗，再浸入洗洁精水溶液中刷洗，清水冲洗、蒸馏水浸泡或冲洗后，擦干、备用。

橡胶制品的清洗新橡胶制品带有大量滑石粉，先用清水将滑石粉冲净，再用2％NaOH溶液煮沸20min，清水冲洗，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，蒸馏水浸泡24h后，取出，蒸馏水冲洗，烘干备用（温度不宜过高）。

使用过的橡胶制品浸人清水中，用洗洁精水溶液煮30min，清水冲洗20min，蒸馏水中浸泡24h后，取出，蒸馏水冲洗，烘干备用。

消毒紫外线: 消毒效果与照射距离成反比。

一般照射30min即可。

优点：是消毒效果好、消毒面积大、使用方便。

缺点：是产生臭氧，对末直接照射的物品无消毒效果。

干热消毒: 消毒时温度为160 ℃，时间90-120min。

优点：使用简便，消毒后物品干燥。

缺点：是热传导慢，消毒时间长。

湿热消毒即高压蒸气消毒。

溶液消毒时，瓶口不可塞死，以免瓶内压力过大破裂。

消毒结束后，先排气，待压力自然下降后，打开锅盖，以免溶液喷出。

消毒好的物品，置70 ℃温箱内烘干后，备用。

优点：是消毒效果好，时间短；缺点：是需专人监管，随时注意压力变化。

过滤除菌用于液体消毒玻璃滤器：常用G-6型滤器，不适于血清等高蛋白液体过滤，因滤板孔径易被堵塞而失去作用。

蔡氏滤器：由金属制成，中间夹有纤维滤膜。

适用于血清及一般液体的过滤。

可用正、负压抽滤。

微型滤器：过滤时可将溶液的损失减少到最小程度。

其过滤效率高，使用方便。

消毒剂消毒：常用乙醇、来苏尔、新洁尔灭、过氧乙酸等，用于消毒超净台、桌椅、墙壁、天花板、地板及操作者的手等。

常用：0.1%新沽尔灭溶液和70%乙醇溶液。

平衡盐溶液(Balanced Salty Solution, BSS)Hanks液缓冲能力较弱，Earle液缓冲能力较强。

在配制消化液宜采用Ca、Mg含量较低的PBS 液或无Ca、Mg离子的D-Hanks液。

天然培养基--血清除特殊适应的细胞或因特殊实验目的而选择无血清培养基外，一般的细胞培养都必须加入血清。

血清加入的原则是既可维持细胞良好地生长，又不浪费血清。

一般为5-40％，通常为10-20％。

常用血清有：新生小牛血清、胎牛血清和马血清等。

肿瘤细胞或恶性转化细胞对血清浓度要求较低，一般5％血清即可满足其细胞生长的需要。

较理想的血清是胎牛血清原因是：血清中胎球蛋白和无机盐离子含量较高，不含有抗体，对细胞生长较有利。

年幼动物血清的质量高于年长动物。

由于不同地区和批次的血清质量差别较大，一个实验用同一批血清为宜。

作免疫或激素试验时，因血清可能引入不必要的免疫因素的干扰。

血清使用前须经彻底的补体灭活（水浴中56℃，灭活30min）。

合成培养基一般地讲，合成培养基只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖或生长，尚需添加血清等。

合成培养基的选择：根据实验要求、实验室条件、细胞种类及研究者本人的经验。

实际应用中发现，一种培养基可适用于多种细胞的培养，常用的有：RPMI-1640、F12、199、MEM，可适用于多种细胞系(株)的培养。

合成培养基的优点1. 使培养条件标准化，易于控制培养的条件；2. 使细胞生长条件稳定，便于体外观察；3. 可规范细胞培养操作程序，简化操作步骤；4. 可准确测定培养体系中物质成分的变化，以评价细胞生长与代谢状况；5. 不含对细胞生长有害的物质，利于细胞生长；6. 可人工合成，来源方便，质量有保证。

细胞分离液(消化液)其作用为1. 在制备原代细胞时消化组织、分散细胞；2. 在细胞传代时使细胞脱离生长表面(瓶壁)和使细胞团离散成单个细胞。

可以单独使用，也可按一定比例混合使用，主要取决于所培养细胞的要求。

胰蛋白酶水解细胞间的蛋白质，使细胞离散。

不同种类的组织或细胞对胰酶的浓度，作用温度和时间的要求不同。

浓度大、温度高和作用时间长对细胞的离散作用就大，但超过一定限度会损伤细胞。

Ca2+、Mg2+和血清会降低其活性。

所以，胰酶要用无Ca2+、Mg2+的溶液配制，在终止消化作用时，可加入血清或含血清的培养液。

胰蛋白酶溶液的常用浓度是0.25 - 1％。

乙二胺四乙酸钠(EDT A)EDTA是螯合剂，其毒性小、价格低廉。

使用浓度为0.02%。

用无钙、镁溶液溶解后，高压灭菌，分装小瓶，于室温或冷藏保存。

胰酶-EDT A消化液胰酶和EDTA联合使用时离散细胞的能力会更高，其终浓度分别为0.25％和0.02％。

滤过除菌，分装小瓶于-20℃保存。

一瓶最好一次用完，不宜反复冻融。

胶原酶胶原蛋白富含甘氨酸、羟脯氨酸，普通的蛋白酶对其水解力弱，因此对甘氨酸、羟脯氨酸丰富的组织细胞的分散需用胶原酶。

胶原酶种类较多，不同生化试剂公司产品的种类、纯度、酶活性都有一定差异，使用时应根据所消化组织的特点，并参考文献及产品说明来确定。