酶江南大学生物化学课件食品学院演示课件
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凝胶过滤色谱 11
6、纯度鉴定
方法主要有： 电泳法
比活测定
7、保存
最后需将酶制剂浓缩、结晶，以便于保存。 酶制品一般应在-20℃下低温保存。
注意条件：干燥、低温、避光、避氧
12
核酶 (ribozyme)
1、 概念
1982年Cech等研究rRNA的基因转录问题时发现： 转录产物rRNA的前体很不稳定，在鸟苷（或5‘GMP）和Mg2+存在下切除自身的内含子，使两个外 显子拼接起来，变成成熟的RNA分子。
19
2、交联法
借助于双功能试剂的作用，使酶蛋白分子之间发生 交联，结成网状结构而制成固定化酶。
即∶ 1个katal酶活力单位是指在特定的 条件下，在1秒钟内能转化1mol底物的酶量。
Kat与U的换算关系如下∶ 1 kat = 6×107 IU
1 IU = 16.67 nkat（n＝10－9)
3
一般情况下，对于酶活力单位人们通常采 用习惯用法。 如∶α-淀粉酶的活力单位是指每小时催化1克 可溶性淀粉液化所需的酶量来表示。
抗体（antibody.Ab)：是机体免疫细胞被抗原激活后， 由分化成熟的B细胞，即浆细胞所合成与分泌的一类能 与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。Ab 是重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌 液中，介导体液免疫效应。
Ab=Ig,Ig≠Ab；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；
也可以用每小时催化1ml 2%可溶性淀粉 液化所需的酶量为1个酶单位。
再如∶蛋白酶的活力单位是每分钟分解酪蛋白 产生1μg酪氨酸所需的酶量。
4
3、比活力(specific activity)
比活力的大小也就是酶含量（纯度）的大小， 即每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg 蛋白来表示。
对于酶制剂来讲，有时也用每克酶制剂或每毫 升酶制剂含有多少个活力单位来表示(即U/g或 U/ml)。
对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。
5
4、催化中心活性 (转换数 turnover number)∶
是指酶在底物饱和时，每秒钟催化中心所 转换底物的分子数。
κcat：每秒钟每个酶分子转化底物的微摩 尔数，在数值上κcat＝ k3
E + S k1 k2
ES k3 E + P
6
几种酶的最大转换数
16
第七节 固定化酶 (immobilized enzyme)
一、固定化酶概况 用物理或化学方法，将酶分子束缚在栽体上，
使其即保持酶的天然活性，又便于与反应液分离， 可以重复使用的酶，它是酶制剂中的一种新剂型。
17
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优点：
[1]、极易将酶与底物，产物分开，简化了提纯工艺。 [2]、酶可以反复使用，并能装柱连续反应，有利于实
8
第六节 酶的分离、纯化
目的：
[1]、为了研究酶的理化特性(包括结构与功能，生物学作用等）。 [2]、作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要有较高的纯度。
胞内酶的分离提纯步骤：
1、选材 2、破碎细胞 3、抽取 4、分离及提纯
9
在酶的纯化过程中应该注意∶
[1]、防止酶蛋白变性。低温、快速、不能过 度搅拌。全部操作需在低温下进行，一般在 0～5 ℃，用有机溶剂沉淀时，在零下15～ 20℃下进行。
这个催化反应是在完全没有任何蛋白质的存在下发生 的，称之为自我剪切，证明了RNA具有催化功能。 为了区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有 催化活性的RNA定名为ribozyme（ribonucleic acid enzyme）
13
抗体酶 (abzyme)
20世纪80年代后期才出现的一种具有催化活力的蛋 白质，其本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶 的属性，所以又称为‘催化性抗体’（catalytic antibody）。
κcat
7
二、酶活力测定法
常规测定酶活力的操作程序为： [1]、样品酶液适当稀释。 [2]、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪 器分析的方法测定反应物的消耗量或产物的生成量。 [3]、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。
1、关于酶液的稀释 2、关于酶促反应条件及保证措施 3、关于反应量的测定
第五节 酶活力的测定
一、酶活力、酶单位、比活力的概念 酶活力（也称酶活性，enzyme activity）∶ 是指酶催化一定化学反应的能力
1、酶活力与反应速度(reaction velocity/rate) 酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化
的某一化学反应的速度来表示的。 酶催化的反应速度越快，酶的活力越高
是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合起来 的一种蛋白质分子设计的新方法。是利用抗体分子及 其多样的结合专一性来产生新的酶。
由于酶作用的实质是酶与底物专一性的结合形成过渡 态，因此，用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物， 将有可能产生具有催化活性的抗体－－－抗体酶
14
15
免疫球蛋白与抗体
免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）：是指具有抗体 活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血 液和其它分泌液中。
现工艺连续化。 [3]、在大多数情况下，可以提高酶的稳定性。 [4]、酶反应过程容易进行严格控制。 [5]、提高了酶的利用率，降低了成本。
缺点：只能用于水溶性底物，适用于小分子底物。
18
二、固定化酶的制定方法
1、载体结合法 用共价键，离子键或物理吸附法把酶固定在纤维素、
琼脂糖、甲壳素、多孔玻璃或离子交换树脂等水不容性载 体上。
1
2、酶活力的单位(U,activity unit)
1961年国际生化学会酶学委员会规定：
在酶作用的最适条件下（最适底物、最 适pH、最适缓冲液的离子强度及25 ℃）下， 每分钟内催化1.0微摩尔底物转化为产物底酶 量为一个国际酶活力的单位。
1 IU = 1μmol/min
2
1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个 新单位“katal”(简称kat)
[2]、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算 总活力和比活力。
[3]、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。
10
5、纯化
除去杂蛋白及非蛋白杂质，并提高酶浓度 。常利用溶解性、 电性、分子大小及某些条件下稳定性差异来纯化
㈠.盐析、分级盐析 ㈡.有机溶剂沉淀 ㈢.选择性变性沉淀 ㈣.色谱法（层析法）
吸附色谱 包括 离子交换色谱
6、纯度鉴定
方法主要有： 电泳法
比活测定
7、保存
最后需将酶制剂浓缩、结晶，以便于保存。 酶制品一般应在-20℃下低温保存。
注意条件：干燥、低温、避光、避氧
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核酶 (ribozyme)
1、 概念
1982年Cech等研究rRNA的基因转录问题时发现： 转录产物rRNA的前体很不稳定，在鸟苷（或5‘GMP）和Mg2+存在下切除自身的内含子，使两个外 显子拼接起来，变成成熟的RNA分子。
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2、交联法
借助于双功能试剂的作用，使酶蛋白分子之间发生 交联，结成网状结构而制成固定化酶。
即∶ 1个katal酶活力单位是指在特定的 条件下，在1秒钟内能转化1mol底物的酶量。
Kat与U的换算关系如下∶ 1 kat = 6×107 IU
1 IU = 16.67 nkat（n＝10－9)
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一般情况下，对于酶活力单位人们通常采 用习惯用法。 如∶α-淀粉酶的活力单位是指每小时催化1克 可溶性淀粉液化所需的酶量来表示。
抗体（antibody.Ab)：是机体免疫细胞被抗原激活后， 由分化成熟的B细胞，即浆细胞所合成与分泌的一类能 与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。Ab 是重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌 液中，介导体液免疫效应。
Ab=Ig,Ig≠Ab；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；
也可以用每小时催化1ml 2%可溶性淀粉 液化所需的酶量为1个酶单位。
再如∶蛋白酶的活力单位是每分钟分解酪蛋白 产生1μg酪氨酸所需的酶量。
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3、比活力(specific activity)
比活力的大小也就是酶含量（纯度）的大小， 即每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg 蛋白来表示。
对于酶制剂来讲，有时也用每克酶制剂或每毫 升酶制剂含有多少个活力单位来表示(即U/g或 U/ml)。
对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。
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4、催化中心活性 (转换数 turnover number)∶
是指酶在底物饱和时，每秒钟催化中心所 转换底物的分子数。
κcat：每秒钟每个酶分子转化底物的微摩 尔数，在数值上κcat＝ k3
E + S k1 k2
ES k3 E + P
6
几种酶的最大转换数
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第七节 固定化酶 (immobilized enzyme)
一、固定化酶概况 用物理或化学方法，将酶分子束缚在栽体上，
使其即保持酶的天然活性，又便于与反应液分离， 可以重复使用的酶，它是酶制剂中的一种新剂型。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优点：
[1]、极易将酶与底物，产物分开，简化了提纯工艺。 [2]、酶可以反复使用，并能装柱连续反应，有利于实
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第六节 酶的分离、纯化
目的：
[1]、为了研究酶的理化特性(包括结构与功能，生物学作用等）。 [2]、作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要有较高的纯度。
胞内酶的分离提纯步骤：
1、选材 2、破碎细胞 3、抽取 4、分离及提纯
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在酶的纯化过程中应该注意∶
[1]、防止酶蛋白变性。低温、快速、不能过 度搅拌。全部操作需在低温下进行，一般在 0～5 ℃，用有机溶剂沉淀时，在零下15～ 20℃下进行。
这个催化反应是在完全没有任何蛋白质的存在下发生 的，称之为自我剪切，证明了RNA具有催化功能。 为了区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有 催化活性的RNA定名为ribozyme（ribonucleic acid enzyme）
13
抗体酶 (abzyme)
20世纪80年代后期才出现的一种具有催化活力的蛋 白质，其本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶 的属性，所以又称为‘催化性抗体’（catalytic antibody）。
κcat
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二、酶活力测定法
常规测定酶活力的操作程序为： [1]、样品酶液适当稀释。 [2]、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪 器分析的方法测定反应物的消耗量或产物的生成量。 [3]、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。
1、关于酶液的稀释 2、关于酶促反应条件及保证措施 3、关于反应量的测定
第五节 酶活力的测定
一、酶活力、酶单位、比活力的概念 酶活力（也称酶活性，enzyme activity）∶ 是指酶催化一定化学反应的能力
1、酶活力与反应速度(reaction velocity/rate) 酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化
的某一化学反应的速度来表示的。 酶催化的反应速度越快，酶的活力越高
是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合起来 的一种蛋白质分子设计的新方法。是利用抗体分子及 其多样的结合专一性来产生新的酶。
由于酶作用的实质是酶与底物专一性的结合形成过渡 态，因此，用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物， 将有可能产生具有催化活性的抗体－－－抗体酶
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15
免疫球蛋白与抗体
免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）：是指具有抗体 活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血 液和其它分泌液中。
现工艺连续化。 [3]、在大多数情况下，可以提高酶的稳定性。 [4]、酶反应过程容易进行严格控制。 [5]、提高了酶的利用率，降低了成本。
缺点：只能用于水溶性底物，适用于小分子底物。
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二、固定化酶的制定方法
1、载体结合法 用共价键，离子键或物理吸附法把酶固定在纤维素、
琼脂糖、甲壳素、多孔玻璃或离子交换树脂等水不容性载 体上。
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2、酶活力的单位(U,activity unit)
1961年国际生化学会酶学委员会规定：
在酶作用的最适条件下（最适底物、最 适pH、最适缓冲液的离子强度及25 ℃）下， 每分钟内催化1.0微摩尔底物转化为产物底酶 量为一个国际酶活力的单位。
1 IU = 1μmol/min
2
1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个 新单位“katal”(简称kat)
[2]、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算 总活力和比活力。
[3]、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。
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5、纯化
除去杂蛋白及非蛋白杂质，并提高酶浓度 。常利用溶解性、 电性、分子大小及某些条件下稳定性差异来纯化
㈠.盐析、分级盐析 ㈡.有机溶剂沉淀 ㈢.选择性变性沉淀 ㈣.色谱法（层析法）
吸附色谱 包括 离子交换色谱