实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取
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X2 0.475 V ' X 2
4．蔗糖酶活力的测定
（1）葡萄糖浓度标准曲线的绘制
• 已绘制，标准曲线如下：
Cglu(mg mL-1)=2.253A520+0.053
• 式中y为葡萄糖含量（mg mL-1 ），x为吸光度A520nm。
（2）样品的稀释
• 粗级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别用pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲 液稀释相应的倍数(I：2×/III: 4×; II:8×/IV: 16× )，使 得酶活力测定时因酶催化水解而产生的葡萄糖含量以在 0.4~1.6 mg之间为佳。
样品酶活力= 产生还原糖mg数×11/5×稀释倍数（U/mL）
思考题
举例说明在细胞破碎和粗分级操作中还有哪些常
用方法，分析各方法的优缺点。
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样的5 m后的体积)
（2）47.5%乙醇浓度沉淀蔗糖酶 • 取出上清液转入烧杯，按 计算使乙醇浓度达到47.5% 所需乙醇体积X2，按X2-X1算出需补加无水乙醇的体积。在 磁力搅拌器上用分液漏斗往烧杯中缓慢滴加冰乙醇使其浓度 达到47.5%。转入离心管中，8000r/min离心10min。弃去上清 液，粗级分I 和II在此步产生的沉淀分别用10ml和20ml pH5.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到“粗级分Ⅲ”和“粗级分Ⅳ”， 分别测量其总体积V3和V4，并进行蔗糖酶活力测定。
（3）酶活力测定
• 取5 ml 5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min， 向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0 ml，立即混匀并计时，准确反 应5min后，加入5.0 ml 0.1mol/L NaOH溶液终止酶反应。另一 对照管先加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液 1.0 ml。 • 取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0 ml及水各 1.0 ml，第3管加蒸馏水2.0 ml，然后各管均加3.0 ml DNS试剂。 置于沸水浴中5 min，取出后用自来水冷却3 min，加蒸馏水至 25 ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm 值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应 的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。 • 一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物 蔗糖水解产生1 mg还原糖所需的酶量。
酵母蔗糖酶的提取
实验原理
蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖 ，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。
从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的 提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学 法、酶法 ），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗 酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离 技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到 浓缩。
在酶的分离提取过程中，酶活性的回收率始终是 评估方法优劣的主要指标，在每一步分离提取操 作中，都需要对样品的酶活力进行分析，计算出 相应的回收率。 本实验采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂法测 定蔗糖酶活力，蔗糖酶分解无还原性的蔗糖成具 有还原性的葡萄糖和果糖，还原糖的量通过DNS 法测定，从而计算出酶活力的大小。
实验步骤（本实验分4组进行）
1、自溶法提取蔗糖酶(1组、2组)
称取10 g酵母粉于烧杯中，加入30ml 0.5mol/L氨水与之 混合，再加入3.5 ml甲苯，混合均匀，然后用磁力搅拌 器在室温下搅拌16-20 h完成自溶。测量自溶液体的体积 ，然后加入1.5倍体积的水，用4 mol/L醋酸调pH至5.8， 倒入离心管中于8000 r/min离心15 min，所得上清液称为 “粗级分II”，测量其总体积V2，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。 由于自溶时间需16-20 h，该步骤由上个班的同学完成， 可以直接从测量体积步骤开始，实验结束需为下个班的 同学准备自溶样品。
wk.baidu.com 3．乙醇分级沉淀初分离
• 粗级分I 和II分别通过乙醇分级沉淀进行粗分离。 （1）32%乙醇浓度沉淀除杂
• 用4mol/L稀醋酸调粗级分pH至4.5，测量体积V后转入烧杯， X 按V X 0.32 计算所需乙醇体积X1，在磁力搅拌器上用分液漏 斗往烧杯中滴加冰乙醇，使乙醇浓度为32%。加完后继续搅 拌5 min。转移至离心管中8000 r/min离心10min。(V为扣除留
2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)
称取5 g酵母粉于小烧杯中，加入30 ml pH5.8的醋酸-醋 酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停 3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处 理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。
破碎液摇匀后转入离心管，加10 ml 缓冲液洗涤烧杯后 并入离心管，8000 r/min离心10 min，取上清液，称为 “粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。
4．蔗糖酶活力的测定
（1）葡萄糖浓度标准曲线的绘制
• 已绘制，标准曲线如下：
Cglu(mg mL-1)=2.253A520+0.053
• 式中y为葡萄糖含量（mg mL-1 ），x为吸光度A520nm。
（2）样品的稀释
• 粗级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别用pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲 液稀释相应的倍数(I：2×/III: 4×; II:8×/IV: 16× )，使 得酶活力测定时因酶催化水解而产生的葡萄糖含量以在 0.4~1.6 mg之间为佳。
样品酶活力= 产生还原糖mg数×11/5×稀释倍数（U/mL）
思考题
举例说明在细胞破碎和粗分级操作中还有哪些常
用方法，分析各方法的优缺点。
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样的5 m后的体积)
（2）47.5%乙醇浓度沉淀蔗糖酶 • 取出上清液转入烧杯，按 计算使乙醇浓度达到47.5% 所需乙醇体积X2，按X2-X1算出需补加无水乙醇的体积。在 磁力搅拌器上用分液漏斗往烧杯中缓慢滴加冰乙醇使其浓度 达到47.5%。转入离心管中，8000r/min离心10min。弃去上清 液，粗级分I 和II在此步产生的沉淀分别用10ml和20ml pH5.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到“粗级分Ⅲ”和“粗级分Ⅳ”， 分别测量其总体积V3和V4，并进行蔗糖酶活力测定。
（3）酶活力测定
• 取5 ml 5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min， 向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0 ml，立即混匀并计时，准确反 应5min后，加入5.0 ml 0.1mol/L NaOH溶液终止酶反应。另一 对照管先加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液 1.0 ml。 • 取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0 ml及水各 1.0 ml，第3管加蒸馏水2.0 ml，然后各管均加3.0 ml DNS试剂。 置于沸水浴中5 min，取出后用自来水冷却3 min，加蒸馏水至 25 ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm 值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应 的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。 • 一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物 蔗糖水解产生1 mg还原糖所需的酶量。
酵母蔗糖酶的提取
实验原理
蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖 ，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。
从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的 提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学 法、酶法 ），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗 酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离 技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到 浓缩。
在酶的分离提取过程中，酶活性的回收率始终是 评估方法优劣的主要指标，在每一步分离提取操 作中，都需要对样品的酶活力进行分析，计算出 相应的回收率。 本实验采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂法测 定蔗糖酶活力，蔗糖酶分解无还原性的蔗糖成具 有还原性的葡萄糖和果糖，还原糖的量通过DNS 法测定，从而计算出酶活力的大小。
实验步骤（本实验分4组进行）
1、自溶法提取蔗糖酶(1组、2组)
称取10 g酵母粉于烧杯中，加入30ml 0.5mol/L氨水与之 混合，再加入3.5 ml甲苯，混合均匀，然后用磁力搅拌 器在室温下搅拌16-20 h完成自溶。测量自溶液体的体积 ，然后加入1.5倍体积的水，用4 mol/L醋酸调pH至5.8， 倒入离心管中于8000 r/min离心15 min，所得上清液称为 “粗级分II”，测量其总体积V2，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。 由于自溶时间需16-20 h，该步骤由上个班的同学完成， 可以直接从测量体积步骤开始，实验结束需为下个班的 同学准备自溶样品。
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• 粗级分I 和II分别通过乙醇分级沉淀进行粗分离。 （1）32%乙醇浓度沉淀除杂
• 用4mol/L稀醋酸调粗级分pH至4.5，测量体积V后转入烧杯， X 按V X 0.32 计算所需乙醇体积X1，在磁力搅拌器上用分液漏 斗往烧杯中滴加冰乙醇，使乙醇浓度为32%。加完后继续搅 拌5 min。转移至离心管中8000 r/min离心10min。(V为扣除留
2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)
称取5 g酵母粉于小烧杯中，加入30 ml pH5.8的醋酸-醋 酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停 3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处 理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。
破碎液摇匀后转入离心管，加10 ml 缓冲液洗涤烧杯后 并入离心管，8000 r/min离心10 min，取上清液，称为 “粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。