第一次筛选的原理与方法
高三生物一轮复习课件动物细胞工程
拓展 提升科学思维
3.科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，尝试说出几种获取iPS细 胞的方法。（结合教材46页）
借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者 用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。iPS细胞最初是由成纤维细胞转 化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。
成纤维细胞 T细胞和B细胞
导入特定基因
导入特定蛋白 小分子化合物诱导
iPS 细胞
治疗阿尔茨海默症 治疗心血管疾病
突破 强化关键能力
1.(2023·山西运城高三模拟)对某种动物的肝肿瘤细胞进行细胞培养，下
列说法错误的是（C ）
A.在利用肝组织块制备细胞悬液时，可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 B.动物细胞培养应在含5%CO2的CO2培养箱中进行，CO2的作用维持培 养液的pH C.为了防止动物细胞培养过程中受污染，可向培养液中加入适量的干扰素 D.在合成培养基中，通常需加入血清等一些天然成分
应用： ①人造皮肤的构建； ②动物分泌蛋白的规模化生产； ③用于药理及细胞发育方面的研究。
考点一 动物细胞培养
4.培养的条件：
糖类、氨基酸、无 机盐、维生素 …
培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分
将细胞所需的营养物 质按种类和所需量严 格配制而成的培养基
含人类未知、细胞生长增
殖所必需的物质，满足细
动物细胞培养 原理：细胞的增殖
的概念和原理 在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术
动
物
动物细胞培养
(1)营养条件 (2)无菌、无毒的环境
细 的条件
(3)温度、pH和渗透压
胞
(4)气体环境
培 动物细胞培养 取动物 单个 细胞 原代 传代
高中生物学选择性必修3动物细胞融合技术与单克隆抗体
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
1．(科学思维)单克隆抗体的制备过程
(1)思考不直接用经过免疫的 B 淋巴细胞(浆细胞)获得抗体的原因是什么？
(2)连线比较单克隆抗体制备过程中几种细胞的特点。
Ⅰ.免疫过的 B 淋巴细胞 ①能无限增殖但不能产生抗体
Ⅱ.骨髓瘤细胞 ②既能无限增殖，又能产生单一抗体
Ⅲ.杂交瘤细胞 ③能增殖、分化形成浆细胞、记忆细胞
诱导融合后得到多种杂 从小鼠体内提取的 B 淋巴
交细胞，另外还有未融合 细胞有很多种，形成的杂
的细胞
交瘤细胞也有很多种
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
项目
第一次筛选
第二次筛选
用特定的选择培养基筛选：
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一
未融合的细胞和同种细胞
筛选
个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化
融合后形成的细胞都会死
2．诱导原理和结果 (1)诱导原理：____细__胞__膜__的__流__动__性______。 (2)诱导结果：形成__杂__交____细胞。
3．诱导动物细胞融合的常用方法
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
(1)化学法：__P_E__G___融合法等。 (2)物理法：电__融__合__法__等。
(1)动物细胞融合过程中既有细胞膜的融合也有核的融合。( √ )
(2)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导方法有聚乙二醇
融合法、灭活病毒诱导法。( × )
(3)动物细胞融合的结果是形成单核的杂交细胞，植物体细胞杂交的结果
是得到杂种植株。( √ )
(4)动物体细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞。( × )
网络构建
新教材·生物（RJ） 选择性必修3
2024年高考生物复习重点、难点、热点专项解析—细胞工程与基因工程
2024年高考生物复习重点、难点、热点专项解析—细胞工程与基因工程高考感知课标要求——明考向近年考情——知规律12.1植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术12.2动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术12.3对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体12.4基因工程是一种重组DNA技术12.5蛋白质工程是基因工程的延伸12.6转基因产品的安全性引发社会的广泛关注12.7举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题12.8世界范围内应全面禁止生物武器2023·湖南基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用2023·湖北DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定2023·广东DNA的粗提取及鉴定的方法2023·新课标DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建2023·北京动物细胞融合与单克隆抗体的制备2023·山东植物细胞工程的实际应用2023·广东植物体细胞杂交技术2023·广东动物的体外受精、胚胎的体外培养、胚胎移植技术2023·浙江动物的体外受精、胚胎的体外培养2023·浙江生物技术的安全性和伦理问题综合2023·海南将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定、基因工程的应用2023·山东PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建2023·湖北动物细胞融合与单克隆抗体的制备2023·浙江动物细胞融合与单克隆抗体的制备、动物体细胞核移植技术和克隆动物2023·全国遗传信息的翻译、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定命题趋势1.细胞工程，胚胎工程的命题多以选择题呈现，基因工程的命题多以简答题呈现，属于年年必考的题目。
2.试题情境以下列几种居多：（1）以单克隆抗体为情境考查细胞工程。
单克隆抗体制备过程中的两次筛选
单克隆抗体制备过程中的两次筛选动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。
在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。
第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。
第一次筛选：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
第二章 第三节 动物细胞工程及其应用 课件2021-2022学年高二下学期生物苏教版选择性必修3
缺点
病毒引入细胞，可能会对细胞 的生命活动产生一定的干扰 有一定毒性，对某些细胞（如 卵细胞）不适用 无（已被广泛应用，细胞融合 的重要技术手段）
4．融合过程 在各种方法的促融合作用下，细胞质膜出现黏连、破裂和融合， 进而发生细胞质融合和细胞核融合，最终形成杂种细胞。
为什么未灭活的病毒不 能作为诱导剂？
生产实验动物和转基因动物、拯救濒危动物、保护动物资源都具有 一定的应用价值。
1．在畜牧业生产中，利用体细胞核移植技术可以加速家畜遗传 改良的进程，促进优良畜群的繁育。
2．在保护濒危物种方面，利用体细胞核移植技术增加动物数量 的工作也已经初见成效。
二、动物细胞培养技术及其应用
20世纪初，一个美国生物学家从蛙胚中分离出一些神经组织，将 这些神经组织和分散的单个细胞在无菌条件下置于青蛙淋巴液中进 行培养，这些组织和细胞存活了数周之久。
（1）为什么从胚胎中选择细胞，这部分细胞具有什么特点？ 分裂能力强，分化程度低。
（2）为什么需要在无菌条件下培养？ 防止杂菌污染培养液和细胞。
（3）为什么要将组织和细胞放在淋巴液中培养？ 不同分裂状态的蛙胚 模拟青蛙体内环境。
（一）动物细胞培养技术 1．概念 动物细胞培养技术是指从动物体内获得相关组织，分散成单个细
各种诱导融合方法的优缺点和具体实例。
3．诱导融合的方法
阅读教材66~67页动物细胞融合的内容，根据表格提示思考： 各种诱导融合方法的优缺点和具体实例。
类型
实例
生物 仙台病毒、疱疹病 方法 毒、腮腺炎病毒
化学 聚乙二醇 方法
物理 电场诱导 方法
优点
仙台病毒在细胞融 合中应用广泛 使用方便，诱导细 胞融合成功率高 对细胞伤害小，易 操作、控制和观察
新教材高中生物第2章细胞工程 动物细胞融合技术与干细胞技术教师用书苏教版选择性必修3
第2课时动物细胞融合技术与干细胞技术课标内容要求核心素养对接1.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物方法,使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
2．概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。
3．简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
生命观念：以细胞结构与功能为基础,理解动物细胞融合的过程及原理。
科学思维：结合具体实例,以流程图的形式表示单克隆抗体的制备过程。
社会责任：说明干细胞在疾病治疗、新药的研制和开发等领域的应用及发展潜力。
一、动物细胞融合技术及其应用1．动物细胞融合技术(1)概念：在一定条件下将两个或多个动物细胞,通过物理、化学或生物方法,结合形成一个细胞的技术。
(2)诱导方法①生物方法：仙台病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒。
利用仙台病毒诱导动物细胞融合的过程示意图如下：②化学方法：聚乙二醇诱导融合法成功率高,但有一定毒性。
③物理方法：采用电场诱导融合法。
对细胞伤害小,易操作、控制和观察。
成为细胞融合的重要技术手段。
(3)融合过程细胞质膜出现粘连、破裂和融合→进而细胞质和细胞核的融合→形成杂种细胞→挑选所需要细胞(4)诱导对象：同物种细胞和不同物种的细胞。
2．单克隆抗体(1)概念：单个细胞进行无性繁殖形成的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
(2)传统抗体的不足含有多种抗体的混合抗体,不能专一性地对付某一类病原体,治疗效果不佳。
(3)单克隆抗体的制备流程(4)应用①制备单克隆抗体靶向制剂：化疗药物与单克隆抗体结合,对肿瘤细胞有较好的选择性杀伤作用。
②疾病诊断：单克隆抗体检测相关抗原是否表达及其表达水平,作为肿瘤诊断的辅助方法；用同位素标记某种单克隆抗体,诊断结肠癌肿瘤病灶是否已经转移。
③导向手术：利用同位素标记的单克隆抗体在体内显示肿瘤位置,用以指导手术范围。
二、干细胞技术及其应用1．干细胞的概念：动物(包括人)胚胎及某些器官中同时具有自我更新和分化能力的细胞。
2．干细胞的形态特点：通常呈圆球形或椭圆球形,细胞体积小,核相对较大。
2022-2023学年 苏教版 选择性 必修三 动物细胞融合技术和干细胞技术(77张)课件
或椭圆球
圆球形
小
大
胚胎干细胞和成体干细胞
全能 干细胞、多能干细胞和单能干细胞
毒理特性
定向分化 排斥 药效
(1)细胞融合体现了细胞质膜的流动性。( √ ) (2)通过诱导只能使同物种细胞发生融合，而不能使不同物种的细胞之间发生融 合。( × ) (3)二倍体动物细胞融合后的杂种细胞仍然是二倍体细胞。( × ) (4)浆细胞与骨髓瘤细胞融合后需要进行筛选。( √ ) (5)不同类型的干细胞，它们的分化潜能完全相同。( × ) (6)干细胞技术可应用于疾病治疗、新药研制和开发。( √ )
第2课时 动物细胞融合技术和干细胞技术
课程内容标准
核心素养对接
(1)阐明动物细胞融合是指通过物理、 (1)科学思维——列表比较动物细胞融
化学或生物学等手段，使两个或多个 合与植物体细胞杂交。
动物细胞结合形成一个细胞的过程。 (2)科学思维——构建单克隆抗体制备
(2)概述单克隆抗体的制备过程。 的流程图。
(2)诱导融合的具体方法有__病__毒___诱__导__融__合__法__、__聚__乙__二__醇__诱__导__融__合__法__、__电__场__诱_ _导__融__合__法___ 。 在 各 种 方 法 的 促 融 合 作 用 下 ， 细 胞 质 膜 出 现 __粘__连__、__破__裂__和__融__合__，进而发生__细__胞__质__融__合__和__细__胞__核__融__合__，最终形成杂种 细胞。
1.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞质膜的流动性、细胞的全
原理
细胞质膜的流动性
能性
酶解法去掉细胞壁后，诱导原
高中生物高考考点84 动物细胞融合与单克隆抗体-备战2022年高考生物考点一遍过
1．动物细胞融合（1）原理：细胞膜的流动性。
（2）融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
（3）意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体（1）制备过程（2）优点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
（3）用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
学科&网考向单克隆抗体的制备过程分析1．如图是单克隆抗体制备过程示意图，相关叙述错误的是A．过程①注射一种灭活病毒可使小鼠体内产生浆细胞B．过程②形成的两两融合细胞只有图中的3种类型C．过程③采用抗原—抗体反应进行特定杂交瘤细胞的筛选D．过程④获得的全部杂交瘤细胞都只能产生同一种抗体【参考答案】B【时候解析】A、灭活病毒可作为抗原刺激小鼠产生浆细胞，A正确；B、过程②形成的融合细胞包括同种细胞融合和异种细胞融合，即过程②还可以形成浆细胞与浆细胞、瘤细胞与瘤细胞间的融合细胞，B 错误；C、可借助抗原-抗体间特异性结合反应进行特定杂交瘤细胞的筛选，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，C正确；D、通过抗原-抗体反应筛选出的杂交瘤细胞只能产生同一种抗体，D正确。
解题技巧制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞2．单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广泛应用于疾病的诊断和治疗。
用H7N9病毒制备单克隆抗体的流程如下图所示：（1）过程③常用的方法是_________________________。
人教版生物选择性必修三学案：2.2.2-动物细胞融合技术与单克隆抗体-【含解析】
二动物细胞融合技术与单克隆抗体必备知识·素养奠基一、动物细胞融合技术1.概念:使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.原理:细胞膜的流动性。
3.诱导融合常用的方法:(1)物理:电融合法。
(2)化学:PEG融合法。
(3)生物:灭活病毒诱导法。
4.判一判:基于细胞融合的技术及其应用,判断下列说法的正误: (1)在动物细胞融合过程中,既有细胞膜的融合,也有细胞核的融合过程。
(√)(2)细胞融合突破物种间的生殖隔离,实现了远缘杂交。
(√)(3)目前细胞融合只能在动物和动物之间、植物和植物之间进行,不能实现动物和植物的细胞融合。
(×)提示:至今,动物和植物之间的细胞融合也获得了成功。
(4)动物细胞融合为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤等提供重要的手段。
(√)(5)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞。
(×)提示:杂交细胞具有4个染色体组,应该是四倍体细胞。
诱导动物细胞融合与植物体细胞杂交融合的方法有什么不同?提示:动物细胞融合能用灭活的病毒进行诱导,植物体细胞杂交融合不能采用此方法。
二、单克隆抗体及其应用1.制备原理:(1)B淋巴细胞的特点:一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,B淋巴细胞在体外不能(填“能”或“不能”)无限增殖。
(2)骨髓瘤细胞的特点:能无限增殖。
(3)杂交瘤细胞的特点:既能大量增殖,又能产生特异性抗体。
2.制备过程:填一填:基于单克隆抗体制备的过程,完成下列问题。
(1)A操作注射特定的抗原,目的是可以从小鼠的脾中得到产生特定抗体的B淋巴细胞。
(2)杂交瘤细胞技术选择融合的两种细胞:细胞①多种B淋巴细胞,细胞②骨髓瘤细胞。
(3)过程B和C为诱导细胞融合的过程,获得的细胞③是多种(填“一种”或“多种”)。
(4)细胞③到细胞④的过程使用特定的选择培养基进行筛选,只有细胞④杂交瘤细胞才能生长,其他细胞不能生长。
(5)细胞⑤来源于细胞④(填数字序号),细胞⑤为抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞,其分泌的抗体能与特定的抗原结合。
单克隆抗体制备两次筛选的原理
单克隆抗体制备两次筛选的原理一、引言单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和性的抗体，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
制备单克隆抗体的关键步骤之一就是筛选，而为了获得更高亲和力和特异性的抗体，通常需要进行两次筛选。
本文将介绍单克隆抗体制备两次筛选的原理及其意义。
二、第一次筛选原理第一次筛选是为了从混合的抗体群体中筛选出特异性较高的单克隆抗体。
筛选的关键是对目标抗原进行免疫反应，然后通过适当的方法分离和检测抗体。
1. 免疫反应：通常采用的方法是将目标抗原免疫到动物体内，激发免疫反应。
免疫反应的方式可以是免疫原注射或者抗原与适当的载体融合，然后注射到动物体内。
2. 分离抗体：在免疫反应完成后，可以从动物体内采集到血清或者细胞，其中含有大量的抗体。
通过一系列的分离步骤，如离心、过滤、层析等，将目标抗原特异性较高的抗体分离出来。
3. 检测抗体：得到抗体后，需要进行检测以确定其特异性。
常用的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化和免疫印迹等。
这些方法可以通过检测抗体与目标抗原的结合情况来评估抗体的特异性。
三、第二次筛选原理第一次筛选得到的抗体是一种多克隆抗体，包含多个亲和力和特异性不同的抗体。
第二次筛选的目的是从第一次筛选得到的抗体中筛选出特异性和亲和力更高的单克隆抗体。
1. 单克隆化：将第一次筛选得到的抗体进行单克隆化处理。
常用的方法有杂交瘤技术和限制稀释法。
杂交瘤技术是将抗体产生的B细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出单克隆抗体。
限制稀释法是将抗体稀释到一定程度，使得每个孔只有一个抗体分子，然后进行培养，最终得到单克隆抗体。
2. 亲和度筛选：通过亲和层析等方法对单克隆抗体进行筛选，选择亲和度更高的抗体。
亲和层析是将抗体与亲和基质结合，然后通过洗脱的方式分离出亲和度较高的抗体。
这一步骤可以进一步提高抗体的特异性和亲和力。
四、意义与应用单克隆抗体制备两次筛选的原理可以提高抗体的特异性和亲和力，使得抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有更广泛的应用。
单克隆抗体多次筛选的原理
单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体多次筛选的原理单克隆抗体是一种可以识别和结合到特定抗原的抗体分子。
在制备单克隆抗体的过程中，需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
下面将介绍单克隆抗体多次筛选的原理。
第一次筛选：免疫原与抗体结合在制备单克隆抗体的第一次筛选中，需要将免疫原与小鼠或兔子等动物的免疫系统接触，激发其产生抗体。
然后从动物体内收集血清，将其与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力较强的抗体。
第二次筛选：抗体与免疫原结合在第一次筛选后，需要将抗体与免疫原结合，筛选出与免疫原结合能力最强的抗体。
这一步通常采用ELISA等技术进行。
第三次筛选：亲和力筛选在第二次筛选后，需要对抗体进行亲和力筛选，以筛选出具有高亲和力的抗体。
亲和力是指抗体与抗原结合的强度，亲和力越高，结合越紧密，抗原的识别和结合能力就越强。
第四次筛选：特异性筛选在第三次筛选后，需要对抗体进行特异性筛选，以筛选出具有高特异性的抗体。
特异性是指抗体只能识别和结合到目标抗原，而不会与其他抗原结合。
通常采用Western blot等技术进行特异性筛选。
第五次筛选：克隆化在第四次筛选后，需要对抗体进行克隆化，以获得单克隆抗体。
克隆化是指将抗体分离成单个细胞，并培养成单个细胞克隆。
通过克隆化，可以获得具有相同特异性和亲和力的单克隆抗体。
总结单克隆抗体的制备需要经过多次筛选，以确保获得高亲和力和高特异性的单克隆抗体。
在筛选过程中，需要进行免疫原与抗体结合、抗体与免疫原结合、亲和力筛选、特异性筛选和克隆化等步骤。
通过多次筛选，可以获得高质量的单克隆抗体，用于科研和临床应用。
筛选含有目的基因的受体细胞的方法
基因工程中重组DNA的两次筛选张辉运江西省遂川中学基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA 片段有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状DNA。
这些环状DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。
如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。
【例】图1是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。
【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。
如图2所示本题中所选用的质粒A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。
在进行导入操作中，质粒自连的环状DNA和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状DNA则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有3种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。
第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。
第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图3D）的平板上印一下。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]
![单克隆抗体制备过程中经过两次筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/9a194bfd6394dd88d0d233d4b14e852458fb39b0.png)
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的H A T选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DN A合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HA T培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
专题9 生物技术与工程之细胞工程与基因工程 环节一 基础考法——自主评价
专题9 生物技术与工程之细胞工程与基因工程环节一基础考法——自主评价1．植物组织培养的常见流程为：外植体的消毒处理、接种→诱导愈伤组织→分化长芽与生根→试管苗过渡等。
下列相关叙述正确的是()A．外植体和培养基需消毒后再接种，接种时需注意外植体的方向，不要倒插B．愈伤组织的诱导受激素组合的影响，不受营养、光照等因素的影响C．获得原生质体后需在无菌水中用纤维素酶和果胶酶混合处理悬浮组织D．试管苗移栽到室外前需用自来水洗掉根部的琼脂，以免琼脂发霉引起烂根解析：选D培养基需灭菌，外植体需消毒再接种，A错误；愈伤组织的诱导受激素组合的影响，也受营养、光照等因素的影响，B错误；在获得植物原生质体时，应用纤维素酶和果胶酶混合液处理实验材料，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体，C错误；经过炼苗的幼苗移栽到实验室外前需要洗苗，目的是洗掉根部的琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，此时试管苗出瓶后需要进行一定时间对外界环境的适应，故洗苗时通常用自来水，D正确。
2．紫罗兰花色丰富、抗虫性强、种子富含亚麻酸。
为了让油菜具有紫罗兰的诸多优良性状，科研人员进行了下图所示实验。
下列叙述错误的是()A．制备原生质体需将植物组织切块用含纤维素酶和果胶酶的等渗或略高渗溶液处理B．细胞融合依赖生物膜的流动性，获得的融合原生质体需放在无菌水中以防杂菌污染C．由愈伤组织到杂种植株培养过程中，需调整生长素与细胞分裂素比例以诱导根、芽分化D．获得杂种植株后，可借助抗原—抗体杂交、病虫感染实验进行新性状表达的鉴定解析：选B用酶解法制备原生质体时，用等渗或略高渗溶液处理是为了避免原生质体吸水涨破，A正确；细胞融合依赖于生物膜的流动性，但获得的原生质体(没有细胞壁)不能放在无菌水，以防原生质体吸水涨破，B错误；由愈伤组织到杂种植株培养过程中，需调整生长素与细胞分裂素比例以诱导根、芽分化，其中诱导生根时生长素/细胞分裂素的比值高，而诱导芽分化时生长素/细胞分化的比值，C正确；获得杂种植株后，可借助抗原—抗体杂交、病虫感染实验进行新性状表达的鉴定，其中前者属于分子水平的鉴定，后者属于个体生物学水平的鉴定，D正确。
单克隆抗体制备中杂交瘤细胞的两次筛选
单克隆抗体制备中杂交瘤细胞的两次筛选(资料)单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HA T选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d 左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S 途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
高三选择性必修三生物知识点总结(问答方式)总复习资料
1.基因工程三大工具，四大步骤分别是？（1）三大工具①限制酶（限制性内切核酸酶）②DNA连接酶③载体（2）四大步骤①目的基因的筛选与获取（前提）②基因表达载体的构建（核心）③将目的基因导入受体细胞（关键）④目的基因的检测与鉴定2.两种DNA连接酶的区别？镁离子的作用？（1）两种DNA连接酶的区别①E.coli DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只连接黏性末端②T4 DNA连接酶：来源于T4噬菌体，既能连接黏性末端，又能连接平末端（但连接平末端的效率相对较低）（2）镁离子的作用激活DNA聚合酶3.什么是启动子？启动子的作用是什么？载体的种类？质粒的特点？构建基因表达载体的目的？（1）启动子①定义：一段有特殊序列结构的DNA片段②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点③作用：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
（2）载体种类①质粒②噬菌体③动物病毒（3）质粒的特点一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
（4）构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
4.基因表达载体的组成及作用？转化的含义？（1）基因表达载体的组成及作用①组成：目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因，复制原点等。
②作用：a.目的基因：编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状；如Bt基因b.启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
c.终止子：使转录在所需要的地方停下来。
d.标记基因：便于重组DNA分子的筛选e.复制原点：DNA复制的起始位点（2）转化的含义目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程5.将目的基因导入微生物，动物，植物细胞的方法？目的基因导入，转录和蛋白质表达的方法分别是？导入动物细胞为什么要选受精卵？（1）将目的基因导入微生物，动物，植物细胞的方法①微生物细胞：Ca2+处理法②动物细胞：显微注射法③植物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法（常用）（2）目的基因导入，转录，表达的方法①目的基因导入方法PCR技术②目的基因转录方法分子杂交技术③蛋白质表达的方法抗原抗体杂交（3）导入动物细胞为什么要选受精卵①体积大，易操作。
高考生物核心知识回顾：9 生物技术与工程
高考生物核心知识回顾九、生物技术与工程一、知识点总结1．生物技术在食品加工方面的应用(1)果酒制作的三个方面①菌种来源：酒精发酵的菌种来自附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
②发酵原理：酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸并进行大量繁殖，在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精。
③酒精的检测：在酸性条件下，重铬酸钾可与酒精反应呈现灰绿色。
(2)果醋的制作原理：醋酸发酵是需氧发酵，需要不断通入无菌空气。
(3)泡菜制作的三个方面①菌种来源：制作泡菜的菌种主要来自蔬菜上的乳酸菌。
②发酵原理：泡菜制作过程的发酵主要是乳酸菌分解葡萄糖产生乳酸的过程。
2．微生物的利用(1)培养基①培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②培养基的营养成分：培养基可为微生物提供碳源、氮源、无机盐和水等主要营养物质。
(2)无菌技术①措施：无菌技术的主要措施包括消毒和灭菌。
②常用方法：培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法，接种环灭菌常采用灼烧灭菌法。
(3)微生物的纯化与计数①纯化微生物的方法：常用平板划线法和稀释涂布平板法。
②微生物的计数方法：常用显微计数法和稀释涂布平板法。
(4)微生物的筛选①尿素分解菌的筛选：以尿素为唯一氮源的选择培养基可以筛选能分解尿素的细菌。
②尿素分解菌的鉴别：在以尿素为唯一氮源的选择培养基中添加酚红指示剂，可以鉴别分解尿素的细菌。
3．植物细胞工程4．动物细胞培养5．动物细胞融合与单克隆抗体6．动物体细胞核移植技术(1)概念：将动物的一个体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体。
(2)基础：动物体细胞核具有全能性。
(3)过程：核移植→重组细胞→重组胚→个体。
7．早期胚胎发育过程受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚。
8．胚胎工程的应用及前景(1)胚胎移植流程(2)胚胎分割9．基因工程的基本操作工具10．基因工程的基本操作程序11．蛋白质工程(1)目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
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第一次筛选的原理与方法：
细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：
在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。
因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。