第2章 蛋白质分子设计

序列设计
• 设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易 于形成α螺旋的残基； • 设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于 形成β折叠片的残基；
• 而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。
溶菌酶结构
• 例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性 分子的设计
• Cutte成功设计了一个具有明显
的核酸酶活性的34肽，该肽可水
在上述的设计工作完成后，要进行合成 或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所 要求的新Pr；
Pr设计的成功与否，必须要有理论与实 验的紧密相结合
一、蛋白质分子设计的分类
• 设计的目的主要有两个：
• 一：为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和 指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性， 增加活性，降低副作用，提高专一性等；
MPH与OPH的序列比对
二者同源性仅为13.6%，确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。 二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解 释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中 活性中心结构的相似性有关。
1 2
3
1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为134~1866，Identities=1720 bp／1733 bp(99％) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为168~1393，Identities=1025／1026(99％) CDS: 341aa (368-1393bp) 两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp
蛋白质修饰 和 基因定位突变 两类。
（一）定位突变的设计目标及解决方法
定位突变常见的设计目标：
提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低 副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程 手段进行结构-功能关系的研究等。
Hartley等于1986年完成了一个设计目标及 解决的办法 ：
• 热稳定性 • 引入二硫桥，增加内氢键数目， 改善内疏水堆积 • 把Cys转换为Ala或Ser，把Trp 转换为Phe或Tyr
例如: 通过引入二硫键期望提高蛋白质的 稳定性，面临的一个问题是：怎样选择合 适的突变位点？ 蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征， 随机选择突变位点引入二硫键会给整个分 子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质 的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。
3．预测突变体的结构
根据所选定的氨基酸残基位点及突
变后的氨基酸种类，利用相关软件进行
基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 ： • 一是进行蛋白质修饰或基因定位突变， 即“小改”；
• 二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即 “中改”。
一、定位突变
基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小 改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个 残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白 质工程中最广泛使用的方法，主要可分为
• 对氧化的稳定性
• 对重金属的稳定性 • pH稳定性
• 替代表面羧基，把Met转换为 Gln、Val、Ile或Leu
• 替换表面荷电基团，His、Cys 以及Tyr的置换 • 专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度
• 提高酶学性质
（二）定位突变的种类
要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序 列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因 直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下3类： 插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外 重组 DNA 技术或 PCR方法。
有机磷水解酶 (Organophosphorus Hydrolase, OPH) 的改造：
提高对特定底物的催化效率;
扩大底物范围;
增加酶的稳定性
Dong Y J, 2005
目的和意义
通过对 MPH 的结晶和三维结构的测定，研究 MPH 活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定 来验证，确定 MPH 的结构和功能的关系，为MPH 的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。 OPH 是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药 降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为 此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对 硫磷水解酶的广泛应用。
第二章 蛋白质分子设计
Chapter two Protein Design
引 言
在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体 外的许多重要任务： 酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子； 抗体起到防护的作用; ……
从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质: 生物合成不需要消耗很多能量 专一性很强 不产生副作用并且能很快降解
内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内 核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）
Pr 内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结 合一个水分子或惰性气体），没有重叠 所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。 蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白 质键所取代
疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及 不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力
有机磷水解酶(OPH)是一种生物催化剂, 能水解有机磷农药 (P—O和P—S键水解)
载体污染序列的分析
在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如 果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ VecScreen/VecScreen.html在线分析。
有机磷农药的长期广泛使用 已经使很多水体及土壤被严重 污染，而且直接影响到人们的 身体健康。
敌敌畏、对硫磷（1605）、 甲拌磷（ 3911）、内吸磷 （1059）、乐果、敌百虫、 马拉硫磷（4049）
例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH ）结构和功能的研究
（二）蛋白质分子设计的分类
• 1．定点突变或化学修饰法 • 2．拼接组装设计法 • 3．从头设计全新蛋白质
三、蛋白质分子设计的原则 (p50)
• 1．活性设计
• 2．对专一性的设计
• 3．Scaffold设计(框架)
• 4．疏水基团与亲水基团需合理分布
• 5．最优的氨基酸侧链几何排列
蛋白质分子设计原理
• 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验 突变设计的效果，
• 同时进一步修正设计方案。
（四）定位突变残基的鉴定 (p56)
根据结构信息
确定残基的突变 蛋白质中功能 残基的鉴定 突变方法鉴定突变 功能残基
利用蛋白质同源性 鉴定功能残基
1．根据结构信息确定残基的突变
• 最有效最直接的方法
• Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该 酶的Cys35被结构相似的Ser所取代后的结构， 发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’ 羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证 实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。
蛋白质应用受限的原因
蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:
(1)蛋白质分子量非常大(10，000-1，000，000)， 不能通过化学方法生产;
(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其 它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的; (3)专一性致使其应用范围受到影响。
蛋白质设计目前存在的问题
突变体的结构预测，将预测的结构与原
始的蛋白质结构比较
4．构建突变体，获得突变体蛋白
依据所设计好的突变，利用化学合 成或PCR等方法构建突变体。进行基因 测序验证突变体后，将突变体进行表达， 纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。
5．突变体蛋白质的检验
• 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定
性、催化活性等，
几何优化及蛋白质动力学研究
结果分析与原先的结构比较
蛋白质合成定位突变 分离、纯化及表征
新蛋白质
Pr突变体设计的3个步骤
利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的 aa
利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构
预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构 稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质
• 二：探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架 的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及 本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找 定性和定量的规律。
（一）蛋白质分子设计的层次
• 分为两个层次：
• 一是在蛋白质三维结构已知基础上的分 子设计 ； • 二是在三维结构未知的情况下，借助一 级结构序列信息及生物化学性质进行分 子设计工作。
（三）定位突变的程序 （p55）
1．建立所研究蛋白质的结构模型
可以通过X射线晶体学、二维核磁共
振等测定结构，也可以根据类似物的结
构或其他结构预测方法建立起结构模型。
2．找出对所要求的性质有重要影响的 位置 • 在改造中如何恰当地选择突变残基 是一个关键问题，这不仅需要分析 残基的性质，同时还需要借助于已 有的三维结构或分子模型。
Match to Vector:
Strong
Moderate
Weak
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Segment of suspect origin: Segments matching vectorStrong match:
1-113, 3838-4071 bp
。
真正的目标序列：114~3,837 bp。
同源序列搜索（Blastn :114-3837 bp ）
蛋白质分子设计原理
金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要 求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂 分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。 对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作 用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主 链的相互作用。
最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立 体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置) 结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题
2．突变方法鉴定突变功能残基
• 随机突变技术
• 删除分析及连接片段扫描突变
3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基
• 高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维 持结构有关 。 • 非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一 性研究。 • 探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变 残基。
（五）定位突变的应用 （p58）
甲基对硫磷水解酶基因的分析
以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kD –ATG:368，398 bp 典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT (320-365bp) 典型的核糖体结合位点:AGGA (381 bp)
结论：MPH基因的CDS: 398—1393（331aa)
1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性 2、三级结构的确定性较差
第一节 蛋白质分子设计原理
计算机模拟 功能分析
基因构建 突变蛋白质产品
Protein 设计循环
蛋白质分子设计的流程
天然蛋白质
蛋白质结构预测
蛋白质三维结构 结构与功能的关系
蛋白质晶体学
数据 的输 入
蛋白质突变体设计及结构预测
解下列底物，但活性依次降低：
polyC、polyA、polyU、polyG。
其主要活性源于二聚体；而 天然核酸酶仅消化polyC、polyU、 polyA。
四、蛋白质分子设计步骤 （p52）
设计目标
蛋白质数据库 修正设计 建立结构模型 获得目标蛋白质 检测
结构信息分析
蛋白质分子设计步骤图
序列合成
第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计
• RNase T1 的结构改造是分子设计中的一 个成功实例 • T1核糖核酸酶含有104个aa残基，天然酶 有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人 在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键， 热稳定性增加。
T4噬菌体溶菌酶
1. 突变引入二 硫键 2. 去除Gly或引 入Pro
3. Ser38→Asp和 Asn144→Asp
图2-3 T4溶菌酶的三维结构（Gassner, et al. 1996）
红色强调的为α螺旋结构域核心中被蛋氨酸置换的10个残基
T4溶菌酶的三维结构 红色强调的为α螺旋中被置换的残基
例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH ）结构和功能的研究