流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
流式细胞仪在生物学中的应用
流式细胞仪在生物学中的应用流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。
它通过将单个细胞与特异性抗体或其他标记物结合，将细胞的多种特性，如细胞大小、内部结构、细胞表面标志等转化为光信号，再通过光电检测系统和计算机数据处理系统进行数据分析和显示。
流式细胞仪在生物学研究中具有广泛的应用价值，为生命科学、医学和生物技术等领域提供了强有力的工具。
流式细胞仪、生物学、细胞特性、抗体、数据分析流式细胞仪主要由样品管、喷嘴、检测器、液流系统、数据处理系统等组成。
其基本原理是利用喷嘴将细胞样品以单细胞悬液形式分散到流动的液流中，每个细胞与一系列特异性抗体或其他标记物结合，从而对细胞特性进行多参数检测。
检测器将接收到的光信号转化为电信号，再由计算机处理系统进行数据处理和显示。
流式细胞仪具有高通量、高灵敏度、多参数同时检测等特点。
细胞分类：流式细胞仪可通过检测细胞表面标志物或细胞内抗原物质，对细胞进行分类和亚群分析，有助于揭示细胞在生理和病理状态下的功能和作用。
细胞计数：流式细胞仪可快速准确地测定细胞样品中的细胞数量和细胞浓度，为生物学研究和临床诊断提供依据。
DNA/RNA提取：流式细胞仪在结合特异性抗体和其他标记物后，可从细胞中提取 DNA或 RNA进行基因表达谱分析、突变检测等研究。
抗体制备：流式细胞仪可用于筛选和鉴定针对特定抗原的抗体，为免疫学研究提供重要工具。
为了进一步了解流式细胞仪在生物学中的应用，我们以一个具体案例进行分析。
研究者采用流式细胞仪对某一肿瘤细胞的生物学特性进行检测，以评估其恶性程度和治疗效果。
实验步骤：（1）收集肿瘤细胞样品，并制备成单细胞悬液；（2）将肿瘤细胞悬液与特异性抗体结合，使抗体与细胞表面标志物或内部抗原物质反应；（3）通过流式细胞仪进行检测，获取光信号并转化为电信号；（4）利用计算机处理系统进行数据分析，绘制细胞特性图谱；（5）根据图谱数据分析肿瘤细胞的生物学特性。
流式细胞术讲义
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。
该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。
在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。
本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。
我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。
通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。
本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。
二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。
2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。
3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。
1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
应用学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞术在免疫学研究中的应用
流式细胞术在免疫学研究中的应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对细胞进行自动分析和分选的技术。
它可以快速、准确地测量细胞的物理和化学性质，如大小、形状、表面标志物、核酸含量等。
在免疫学研究中，流式细胞术已经成为了一种重要的研究工具，广泛应用于免疫细胞的分型、功能和活化状态的检测等方面。
1. 免疫细胞分型：流式细胞术可以通过检测细胞表面标志物的表达，对免疫细胞进行分型。
例如，可以通过检测 CD4 和 CD8 分子的表达，将 T 细胞分为辅助性 T 细胞（CD4+）和杀伤性 T 细胞（CD8+）；通过检测 CD19 分子的表达，将 B 细胞分为 B1 和 B2 细胞等。
2. 免疫细胞功能检测：流式细胞术可以通过检测细胞内的分子，如细胞因子、活性氧等，来评估免疫细胞的功能。
例如，可以通过检测细胞内的干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，来评估 T 细胞的活化状态和功能。
3. 免疫细胞活化状态检测：流式细胞术可以通过检测细胞表面标志物的表达和细胞内的分子，来评估免疫细胞的活化状态。
例如，可以通过检测 CD69 和 HLA-DR 分子的表达，来评估 T 细胞的早期活化状态；通过检测 CD25 和 FoxP3 分子的表达，来评估调节性 T 细胞（Treg）的活化状态。
4. 免疫细胞分选：流式细胞术可以根据细胞的物理和化学性质，对细胞进行分选。
例如，可以通过分选 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，来进行 T 细胞的功能研究；通过分选调节性 T 细胞（Treg），来进行 Treg 细胞的功能研究等。
总之，流式细胞术在免疫学研究中具有重要的应用价值，可以帮助我们更好地了解免疫细胞的分型、功能和活化状态，为免疫学研究提供了有力的技术支持。
流式细胞术
流式细胞术一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur 是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
fcm是什么意思
回答：流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
延伸：其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
fcm全称“Firebase Cloud Messaging”，是一项针对Android、iOS及网络应用程序的消息与通知的跨平台解决方案，目前可免费使用；该服务由Google拥有的Firebase公司提供。
Firebase云消息传递（英语：Firebase Cloud Messaging，通常简称FCM），也称Firebase云信息传递，前身为Google云消息传递（GCM），是一项针对Android、iOS及网络应用程序的消息与通知的跨平台解决方案，目前可免费使用。
该服务由Google拥有的Firebase公司提供。
Firebase已于2014年10月21日宣布被Google收购，价格未公布。
[2]Google云消息传递的官方网站现已指向Firebase云消息传递，视作新版Google云消息传递。
由于中国大陆与谷歌的连接不畅，大多数中国大陆国产应用（如QQ等）都没有接入FCM，转而使用心跳机制来确保消息推送。
[4]微信在部分Play版本被发现内置了FCM，但被认为可能只是用以唤醒相关进程，而非用于推送聊天消息。
除此之外，日本的即时通讯应用Line也对中国、台湾手机号注册的账户实行了心跳机制的推送，而其他国家或地区以及未绑定手机号的账户使用FCM推送。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术FCM概述
FCM基本知识概述一. 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是从70年代逐渐兴起的一种利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
它是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技分析检测技术，具有检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本等优点，已被广泛应用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中都发挥着重要的作用。
一、流式细胞术的基本原理待测样品（如细胞、染色体、微生物或人工合成微球等）经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过鞘液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，依次通过流动室检测区域。
以不同波长的激光作为激发光源，垂直照射检测区域的样品流，被荧光染色的生物颗粒在其照射下，产生散射光和激发荧光，它们同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。
前向小角度的光散射信号（forward scatter, FSC）反映了细胞体积的大小；侧向90°方向的光散射信号（side scatter, SSC）反映了细胞内颗粒的复杂情况；激发荧光信号代表了所标记的被测细胞内部颗粒的信息。
这些光信号被转化成电信号，传送到计算机，经A/D 转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存到计算机上，以备脱机后的数据处理和分析。
细胞的分选则是指根据所测定的各个参数将指定的细胞亚群从细胞主群体中分离出来的一种方式。
具体的操作是在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动能使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷，让其在高压电场的作用下发生偏转，落入各自的收集容器中，而不予充电的液滴则落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞
写在课前的话流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。
它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。
一、流式细胞术概念(一) 概念流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。
目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。
(二) 流式细胞术的特点1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。
2. 准可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。
3. 精通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
（三）流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）操作流程流式细胞术的操作流程简单概括为：培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、骨髓、外周血、脱落细胞等不同类型的样品。
首先制备成单细胞悬液后，再经过荧光染色就可以上机进行检测。
如果需要分选，可以通过细胞分选把感兴趣的细胞分选出来进行进一步培养或者进行其他生物学行为的研究。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
流式细胞术简介
FCM是集现代电子物理技术、激光技术、电 子计算机技术和流体力学等于一身的高科技仪器， 开创了荧光技术的又一个崭新的领域。 近年来，此项技术发展十分迅速。具有更高灵 敏度、更高分辨率、双激光、多荧光参数分析的仪 器不断问世，并在朝着经济实用、操作简便、小巧 精制、自动化程度高的方向发展。 确信，流式细胞分析技术进一步与其它技术的 结合，将极大的推动生物医学的发展。
FACS Vantage DiVa
FACSAria
The BD FACSAriaTM cell sorter sets a new standard for high performance flow cytometry. Based on a revolutionary new design in instrumentation, this easy-to-use benchtop system delivers high-speed sorting and multicolor analysis.
BD公司自从1974年第一台商用流式细胞仪问世一直致力 于流式细胞仪的创新。 BD FACSCanto™ benchtop flow cytometer继承了这个传统。它的主要特这是： 1. 真6色容纳能力——从少量的样品量中获取每个细胞更 多的信息。 2. 敏感性(<50 MESF PE, <100 MESF FITC*) ——解决最 微弱的events。 3. 快速(10,000 events/sec) — 加速稀少事件的获取。 4. Low carryover (<0.1%) — 使样品污染最小化。 5. 更换透镜键盘化 —不用工具更换滤光片。 6. Fixed optical alignment — 免除用户调节。 7. 日常管理自动化 — 为科研节约更多时间。
流式细胞术的工作原理及其临床应用
流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。
本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。
我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。
然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。
我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。
二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。
其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。
待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。
这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。
在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。
这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。
电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。
流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。
这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。
流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。
这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。
流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。
这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。
三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。
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第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
S
G1
G0 Quiescent cells
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
Traditional Analysis -- Percent positive
2）DNA链损伤“TUNEL”法 3）Annexin-V-FITC/PI双染法 4）线粒体细胞膜电位的检测 5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法 检测基因
第五节 免疫功能的检测
（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例， 及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进 行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞）， CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）： 辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：naï ve辅助/诱导T 细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细 胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤； CD3+/CD8/45RA+：naï ve抑制/杀伤T细胞； CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞 内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞， CD4+/IFN-γ+。 （2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免 疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判 断、移植免疫检测等。
正常BM各系细胞比率
淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%;
单核2-6%+ 粒细胞:40-60% 有核红:20包括血小板、血管内皮细胞等） 在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中 在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞 膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的 生理和病理过程。八十年代在WHO和国际 免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分 化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为 一个分化群 CD: cluster of differentiation/ cluster designation
流式细胞仪结构
• 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 • 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 • 存储、显示、分析系统：计算机。 • 细胞分选系统
流式免疫分型技术要点
抗体标记的方法
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适
合弱抗原的检测
实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
流式细胞术 （Flow Cytometry,FCM)
作者：笛风
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
Linear Fluorescence in FL2
10000
1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
10
cell and bead neg
1
10 2
103
104
10
5
Molecules PE per Bead
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广 biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4
细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining
Caspases
Annexin V Assay建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡
流式“TUNEL”
Intracellular Cytokine-Protocol
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参 数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC
第四节 凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡 细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释 放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的 固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少， 成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡 细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影 响结果的准确性。 可参看文章： /content/cell/20040914791.htm /content/cell/20040914792.htm
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
流式常见图形 (Histogram Plot)
适用于：单参数分析
流式常见图形 (Dot Plot)
适用于：多参数分析
第二节 流式细胞术的科研应用
分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量
流式应用常见范围
细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
第六节 FCM在血液学中的应用
1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴 瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、 免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和 淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之 一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别 被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰 酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate），FL2：PE （藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄 素叶绿素蛋白，peridinin chlorophyll protein），FL4： APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干 细胞移植及基因治疗方面的检测。 3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现 活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如 果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的 原因为血小板破坏过多所致。
4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发 生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成 障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的 GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的 主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞 或WBC上出现CD55或/和CD59的减少， 可诊断为PNH。