酶工程2微生物发酵产酶

第二章 微生物发酵产酶
本章内容


酶的发酵生产的概念——→优良菌种的筛 选——→发酵的基本类型——→发酵工艺 过程及条件控制 *酶的生物合成模式

在酶制剂发展的早期，酶多是从动植物原 料中提取的。但是由于它们的生长周期长， 酶在动植物组织中的含量低，又受地理、 气候和季节等因素的影响，来源受到限制， 不适于大规模的工业生产，因此除了部分 用于医疗、疾病诊断及食品工业的酶外， 目前基本都是以微生物作为生产酶的酶源， 产酶微生物的发酵技术在酶生产中是极为 重要的。
2、延续合成型：
（1）酶的合成伴随着细胞的生长开始，但在细胞生长进 入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。 （2）属于延续合成型的酶可受诱导但不受分解代谢物阻 遏和产物阻遏，而且该酶所对应的mRNA是相当稳定的， 在生长平衡期以后相当长所一段时间内继续用于酶的合 成。

5、高产菌株的选育 目前，优良菌种的获得一般有三条途 径：一是从自然界分离筛选；二是用物理 或化学方法处理、诱变；三是用基因重组 或细胞融合技术。
5、常用的产酶微生物
（1）细菌 大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背 景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主， 被改造成表达优良性状的“工程菌”。大肠杆菌可 生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、 β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、 DNA连接酶、核酸外切酶等。 枯草杆菌：用途很广，可用于生产α-淀粉酶、 蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。 （2）放线菌 链霉菌：生产葡萄糖异构酶的主要微生物
2、控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的 阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分 解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的 碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养 基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物 阻遏的浓度。
3、添加表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性 剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机理 尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细 胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细 胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的 反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些 表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用， 可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生 产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提 高几倍到几十倍。
第二节 酶的生产方式
按发酵方法可分为：
一、固体发酵法（传统方法）


固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他 必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后， 加入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。 主要用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉 和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久历史。我国传统的各种酒曲、 酱油曲等都采用这种方式进行生产，其主要目的是获得淀粉酶和 蛋白酶。
五、溶解氧的调节控制 微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的 代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧 化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性 厌气菌则两者兼而有之。 在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能利 用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。由于氧是 难溶于水的气体，培养基中含有的溶解氧并不多， 很快就会被细胞利用完。为此，必须在发酵过程 中连续不断地供给无菌空气，使培养基中的溶解 氧保持在一定水平，以满足细胞生长和产酶的需 要。
三、固定化细胞或固定化原生质体发酵
1、固定化细胞发酵（70年代后期发展起来） 固定化细胞指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内 进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。 优点： （1）固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高 生产能力； （2）发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长的时间，易于连续 化、自动化生产； （3）细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发 酵，大大提高设备利用率； （4）发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等。 缺点： 历史不长，技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器， 只适用于胞外酶的生产等。
发展微生物作为酶生产的来源主要有 以下原因：

①微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高。
②微生物培养方法简单。 ③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。
④微生物有较强的适应性和应变能力。

经过预先设计，通过人工操作控制，利用 细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物 细胞）的生命活动，产生人们所需的酶的 过程，称为酶的发酵生产。
四、温度的调节控制 细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有 所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于 在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长 细胞产酶时间。 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同 的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最 适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶 阶段，则需控制在产酶的最适温度。
保藏细胞 ↓ 细胞活化 ↓ 原生质体←细胞扩大培养→固定化细胞 ↓ ↓ ↓ 固定化原生质体 →发酵 预培养 ↓ 培养基 分离纯化 无菌空气 ↓ 酶
一、细胞活化与扩大培养 保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的 斜面培养基上，在一定的条件下进行培养， 以恢复细胞的生命活动能力，这就叫细胞 活化。 为了保证发酵时有足够数量的优质细胞， 活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩 大培养。用于细胞扩大培养的培养基称为 种子培养基。
4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作 用机理尚未阐明的物质，它可能是酶的激 活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生 长因子，或有害金属的螫合剂，例如添加 植酸钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的 5’-磷酸二酯酶的产量提高2—20倍。
第四节 酶生物合成模式
1、 同步合成型： （1）酶的合成与细胞生长同 步进行。当细胞进入对数生 长期，酶大量产生，细胞生 长进入平衡期后，酶的合成 随着停止。 （2）同步合成型又称生长偶 联型。其生物合成可以诱导， 但不受分解代谢物阻遏和反 应产物阻遏。 （3）当除去诱导物或细胞进 入平衡期后，酶的合成立即 停止，这表明这类酶所对应 的mRNA是很不稳定的。
首先必须选择合适的产酶菌株 然后采用适当的培养基和培养方式进行发 酵，使微生物生长繁殖并合成大量所需的 酶 最后将酶分离纯化，制成一定的酶制剂。

第一节 优良产酶菌种的筛选
酶的发酵生产的前提之一，是根据产酶的 需要，选育到性能优良的产酶细胞。 优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛 选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首 要环节，一个优良的产酶菌种应具备以下 几点：
4、生长因素 凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质 都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、 嘌呤、嘧啶、维生素等。 与微生物有关的维生素主要是B族维生素， 这些维生素是各种酶的活性基的组成部分， 没有它们，酶就不能活动。
三、pH值的调节控制
不同细胞生长繁殖的最适 pH值有所不同。一 般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性 至微碱性（pH 6.5~8.0）；而霉菌、酵母则偏好微 酸性（pH 4.0~6.0）；植物细胞生长的最适pH为 5~6。 培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。 若阴离子 ( 如醋酸根、磷酸根 ) 被吸收或氮源被利用 后产生NH3 ，则pH上升；阳离子(如NH4、K+ )被吸 收或有机酸的积累，使pH下降。
2、固定化原生质体发酵（80年代中期发展起来） 原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物 质组成的微球体。 优点： （1）变胞内产物为胞外产物。 （2）提高酶产率。 （3）稳定性较好。 （4）易于分离纯化。 缺点： 制备较复杂，发酵培养基中需要维持较高的 渗透压，而且还要防止细胞壁的再生等。
第三节 发酵工艺条件及其控制
（3）霉菌 黑曲霉：生产糖化酶、α-淀粉酶、果胶酶、酸性蛋 白酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶等 米曲霉：生产糖化酶和蛋白酶，在我国传统的酒曲 和酱油曲中得到广泛应用 红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉 （4）酵母 啤酒酵母：主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面 包制造。用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶 等的生产 假丝酵母：单细胞蛋白的主要生产菌

优点：设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别 适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。 缺点：劳动强度较大，原料利用率较底，固体发酵条件 控制不易均匀，生产周期较长。
二、液体深层通气发酵法（最广泛应用）



采用液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后 接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。 液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 优点： ⑴不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和 动物细胞的悬浮培养和发酵。 ⑵机械化程度较高，技术管理较严，酶产率较高，质 量较好，产品回收率较高。 ⑶易于为人为控制。
二、培养基的配制
培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵 的各种营养物质的混合物。 由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合 成过程，因此微生物产酶的培养基要有利于蛋白 质的合成。
1、碳源 构成菌体成分的重要元素， 产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料， 同时又是化能异养型微生物的能量来源。

在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选 择以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用。 2、氮源 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要 求进行选择和配制。一般说来，动物细胞要求有机氮， 植物细胞主要要求无机氮，微生物细胞中，异氧型微生 物用有机氮，自氧型微生物用无机氮。
3、无机盐类 ①构成菌体成分； ②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等； ④作为自养菌的能源。 当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而 在较低浓度时却能刺激生长。 在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离 子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之 一，也是芽孢形成所必需的。

a 繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期。
b 容易培养和管理，能在便宜的底物上良好生长。 c 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体 侵袭。 d 产生的酶容易分离纯化。