α-淀粉酶生产重要参数

α-淀粉酶发酵的生产工艺设计摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

对α-淀粉酶性质及其应用进行了相关综述。

关键词：α-淀粉酶；生产工艺设计；性质；应用Abstract：α-amylases are universally distributed throughout the animal，plant and microbial kingdoms．They can hydrolyse starch molecules to give diverse products including dextrins and progressively smaller polymers composed of glUcose units．α-amylases are one of the most popular and important form of industrial amylases．These enzymes are applied in baking industry，the processing of starch，ferm entation，brewing industry，textile and paper industries．The present review highlights the properties and applications ofα-Amylases．Key words：α-amylase；properties；applications1 绪论1.1α-淀粉酶性质简述1.1.1α-淀粉酶简述α-淀粉酶广泛存在于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中[1]。

米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1，4,葡萄糖苷键。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶.也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[2]。

作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH值范围5.5~7.0，最适pH值为6.0。

Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。

可催化水解α-1,4-糖苷键，但只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖[3]。

主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中[4]。

1.1.2 α-淀粉酶的结构目前，已对很多不同种类和来源的α-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图[5]。

研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku 左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。

为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的[6]。

1.1.3 底物特异性α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同[7]，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等[8]。

1.1.4 最适pH和最适温度反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。

因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。

通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。

真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH 为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。

另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围[9]。

不同微生物来源的α-淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，而最高的能达到100℃～130℃。

另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[10]。

1.1.5 金属离子α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA 等对α-淀粉酶也有抑制作用[11]。

α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。

Ca2+对α-淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。

结晶高峰淀粉酶A(TAA)包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。

通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。

用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。

用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。

加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。

通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对α-淀粉酶没有影响[12]。

1.1.6电场强度实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。

我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象．姚占全等[12]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响[13]。

第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.5～6.0kV／cm 范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%～26.2%之间。

第1O天测定，酶活性变化幅度在0.2％～16.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失[14]。

2 工艺流程设计2.1 生产方法的选择(一)固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干[15]。

(二)深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。

将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。

然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时[16]。

当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时[17]。

2.2.2α-淀粉酶培养基的制作（1）培养基的类型培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型[18]。

（2）孢子培养基孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异[19]。

对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。

α-淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。

（3）种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子[20]。

对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

α-淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

（4）发酵培养基发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

α-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵[21]。

2.2.3 种子扩大培养本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。

设计流程如下：孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐1）孢子制备将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

2）种子制备将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。

然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。

此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

3）发酵罐培养培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。

培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。