实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位

通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷 酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵 作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显 示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。
反应如下：
β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色)
2.巨噬细胞的特性
组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或 玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细 胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体 内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。 巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用 （phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用 （pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液 泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清 除。
A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml 。 B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O 2.72g加蒸馏 水至１00毫升。 取A液３０毫升＋B液70毫升＋蒸馏水300毫升。 6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性 淀粉６.0g，蒸馏水１00ml，煮沸灭菌，４℃保存，使 用时热水浴融化。 3.仪器、 用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、 解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
一、实验目的
1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作 步骤。 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
二、实验原理
酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要 存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨 噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH 条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现 出一系列显著的变化， 如膜活性增高和酸性磷酸 酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶 活力被显示。
四、实验方法与步骤
１.前处理
（１）小白鼠每日腹腔注射６％淀粉肉汤１ml， 连续注射３天．
（２）在第３－４天,再向腹腔注射１ml生理盐 水，过３～５min用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹 腔，把内脏推向一侧，用不带针头的注射器或吸管 吸取腹腔液．
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２.制片
1.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开， 自然干燥。 2.放入作用液中，37℃ 保温30min 。 3.蒸馏水漂洗片刻。 4.放入甲醛钙固定液中固定5min 。 5.蒸馏水漂洗片刻。 6.放入2%硫化铵液3-5min 。 7.蒸馏水漂洗,镜检。
3.对照实验:
标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上37步。
五、实验中的注意事项
1.铅离子的浓度，作用时间
作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅 离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并 可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也 可发生酶扩散和核染色的现象．
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
七、实验报告及思考题
简图表示所观察到的酸性磷酸酶显示结果 和分布。 思考题 在制片的过程中为什么要采用冷冻涂片？ 简述巨噬细胞（MΦ）发育及MΦ分布？
3.小鼠的处死
脊柱脱臼法 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下 压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，瞬间 死亡 。 皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液 不流入腹腔。 腹腔内的冲洗液要全部吸干。
六、实验结果与分析
巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕 黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷 酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色 沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。
七、相关理论知识
巨噬细胞（MΦ）发育：骨髓多能干细胞→定向干 细胞（髓样干细胞）→单核母细胞→前体单核细 胞→单核细胞→血液→组织（分化为巨噬细胞） MΦ分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎 存在于所有表皮和黏膜下组织。 MΦ形态：有伪足，马蹄状单核，细胞形体大。 MΦ分离纯化：小鼠和大鼠腹腔内有丰富的巨噬细 胞，可用腹腔清洗的方法获得较多细胞悬液。正 常小鼠每只可收集腹腔渗出细胞106，其中30%为 巨噬细胞，如果给小鼠腹腔注射某种刺激物，可 使巨噬细胞渗出增加，易于分离更多的巨噬细胞。
2.腹腔注射
1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.5～7号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的 尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这 样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大 肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮 下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在 腹部的另一侧进入腹腔。
三、实验材料、试剂和仪器
1.材料
小白鼠
2.试剂
1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙 10ml,蒸馏 水80毫升。 2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加 0.05mol/L 乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地 滴加3% β -甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产 生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存) 。 3)2％硫化铵溶液：硫酸铵2毫升＋98毫升水。 4)0.05mol／L乙酸缓冲液。