临床输血治疗技术
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• 免疫细胞
• 干细胞 (Stem Cell, SC)
Human embryonic stem cell colony on mouse embryonic fibroblast feeder layer
免疫细胞
• 免疫细胞，通过它可 以抵抗病毒、细菌、 杀灭肿瘤，保证人体 功能正常和健康
A scanning electron microscope (SEM) image of a single human lymphocyte.
临床输血治疗技术
第一节 治疗性血液成分去除及置换术
教学目的
熟悉血液成分去除术的常用技术及要求 掌握血浆置换术的原理、病例选择、置换液选 择 掌握常见的血液成分单采术
了解 血液成分去除术及单采术的常见不良反应类型 及救治
教学安排
血液成分置换术 血液成分单采术
概述
• TBCE:
熟悉临床常用细胞治疗的细胞制备及质量
* 掌握外周血干细胞采集、保存、运输及质量要求 * 掌握树突状细胞的制备及质量 * 掌握细胞因子诱导的杀伤细胞的制备及质量 * 掌握树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞的制备及质量
了解
– 《人体细胞治疗和基因治疗指导原则》FDA 1998年
教学安排
概述 临床常用的细胞治疗方法、原理及制备
教学安排
• 概述 • 临床常用的细胞治疗方法、原理
及制备 • 开展细胞治疗的条件与要求
概述
• 细胞治疗(cell-based therapies): 指利用某些具有 特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获 取，或/并进行体外扩增、培养等处理后，使其 具有增强免疫、杀灭病原体和肿瘤细胞、促进 组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达 到治疗疾病的目的。
病理性成分的去除效率
1个血浆容量置换，去除约63.2% 2个血浆容量置换，去除约86.5% 3个血浆容量置换，去除约95.0%
血液成分剩余率
1个血浆容量置换，剩余率为36.8% 2个血浆容量置换，剩余率为13.5% 3个血浆容量置换，剩余率为5.0%
病理性血液成分去除原则
血液中含有能被TBCE去除的、明确的病理性成分 病理性成分能充分去除，并能有效地消除或减轻
特点
• 脐血MSCs在不同的培养基中能够向心肌细 胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等分化
• 脐血MSCs可诱导生成神经样细胞，并表达 神经特异性烯醇化酶（NSE）以及其他神 经细胞表面标志
• MSCs在软骨诱导培养基中可诱导培养成具 有软骨细胞特性的细胞
3. 树突状细胞
Dendritic cells in skin
• DC与T细胞结合
TCA
– 治疗性红细胞单采术 – 治疗性白细胞单采术 – 治疗性血小板单采术 – 治疗性外周血造血干细胞单采术
临床应用
TCA 真性红细胞增多症 镰状细胞性贫血 白血病 原发性血小板增多症
不良反应和并发症
低血症 心血管反应 反跳现象 过敏反应 凝血功能异常 穿刺部位血肿
干细胞
• 干细胞，定向分化出多种功能独特的细胞
• 干细胞，修复受损的人体器官组织
Mouse embryonic stem cells with fluorescent marker
干细胞分类
分化潜能：
• 全能型干细胞（Totipotent stem cells） • 多能型干细胞（Pluripotent stem cells） • 单能干细胞也称专能或偏能干细胞（Unipotent
• 成熟DC形态特殊，具有许多树突状或伪足样突起， 表达高水平的共刺激因子和粘附因子
DC的生物学功能
• 抗原提呈作用 • 高水平表达共刺激分子和粘附分子而促进
DC与T细胞的结合 • 调节T、B淋巴细胞分化发育 • 诱导免疫耐受
DC的制备
DC的制备
• 分离外周血单个核细胞，贴壁2h后加入 GM-CSF、IL-4 诱导一定时间（通常714d），观察细胞形态，表面标志
• Cell therapy is the transplantation of human or animal cells to replace or repair damaged tissue.
输血与细胞治疗
• 输血作为一种治疗手 段在临床得到了广泛 的应用，其本身就是 一种广义的细胞治疗， 特别是成分输血的推 广和应用，使人们认 识到针对性输注某一 特定血液细胞或成分 能够更好地达到治疗 的目的
• 经动员后当PBSC达到峰值 • 最佳时间: 白细胞计数在（40-50）×109 /L，
单核细胞比例＞10%为最佳采集时机 • 通常白细胞计数升高到10×109 /L以上，外
周血CD34+细胞＞1%，或CD34+细胞峰值 位于（20-40）×106 /L便可以采集 • 容易采集到108数量级的干细胞
• 经物理、化学或生物因 素的动员，干细胞会大 量释放到循环血液中， 从而外周血中造血干细 胞含量增加数十倍甚至 数百倍
教学安排
概述 临床常用的细胞治疗方法、原理及制备
外周血造血干细胞
• 外周血造血干细胞（peripheral blood stem cell, PBSC）移植
• 通过动员采集外周血中的干细胞进行造血 干细胞移植
• 又称为集落形成单位成纤维细胞（colony forming unites fibroblasts，CFUF）
特点
• 来源：MSCs存在于多种组织中，特别是脐 血来源的MSCs较为原始
• 性能：分化能力强，可在体外进行分离、 培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次 传代扩增仍能保持旺盛功能
特点
• 特征：MSCs不表达或低表达免疫排斥相关 标记，免疫原性低
PBSC移植的特点
• 全自动血液成分分离机从外周静脉血中采 集
• 重建造血快 • 在受者体内植入率高 • 来源方便、移植痛苦少，降低了患者的经
济负担
PBSC的采集
• 常用的造血干细胞动员的方法有：
• 化疗药物（大剂量环磷酰胺）、造血细胞 刺激因子（G-CSF）、化疗药物联合造血 细胞刺激因子
PBSC的采集
• 人外周血中DC细胞仅占单个核细胞的1% 以下，但是这些DC的表型和状态并不相同， 不同来源的DC的发育过程及其功能均有所 不同
特点
• 人体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共 刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞 增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有极强的抗原 吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些 因素刺激时即分化为成熟DC
置换液的选择原则
维持正常血浆容量 补充患者需要成分 凝血异常 抑制病理性成分产生 能大量结合病理性成分 患者临床情况
临床应用
TPE AABB分为四类：
第一类标准的可接受治疗的疾病 第二类可接受辅助治疗的疾病 第三类疗效不定的疾病 第四类研究缺乏效果的疾病
• 特征：免疫缺陷细胞，不须经过严格配对 使用，异体移植无免疫排斥反应或反应较 弱，适宜于不同个体之间的移植
特点
• 脐血MSCs具有“横向分化”或“跨系分化”的能 力，不仅支持造血细胞的生长，还可以在不同诱导 条件下，在体外分化为多种组织细胞
• 运用细胞片技术，将单层的一整片MSCs移植到心 肌梗死后瘢痕组织部位，结果移植薄片逐渐变厚， 新血管形成，移植的细胞有阻止心室壁变薄的趋势， 改善心脏功能
治疗性单采术
• 治疗性单采术, 治疗性血细胞单采术 (therapeutic hemocytes apheresis, TCA)
治疗性红细胞单采术 治疗性白细胞单采术 治疗性血小板单采术 治疗性外周血造血干细胞单采术
生理学基础和作用机制
病理性成分： （1）来自造血系统异常增殖产生的过量或功 能异常的血细胞 （2）来自体内、外原因（直接或间接引起的 含量或功能异常的血浆成分 （3）来自内、外源性毒性物质
stem cells）
造血干细胞
• 造血干细胞 （hematopoietic stem cell, HSC）
造血干细胞
• 造血干细胞移植：指对患者进行全身放疗、 化疗和免疫抑制预处理后，将正常供者或 患者自身的造血干细胞回输到患者体内， 以重建其正常的造血与免疫功能
造血干细胞
• 人的造血干细胞主要分 布在骨髓中，约占1%5%，外周血中不到 0.1%
• 自体移植用来治疗自身免疫性疾病，作为一种基 因治疗的有效手段正在应用于通过对干/祖细胞或 淋巴细胞进行修饰，以纠正代谢缺陷和进行免疫 治疗
2. 间充质干细胞
Mesenchymal stem cell
定义
• MSCs是存在于骨髓中一类非造血干细胞， 在适宜的条件下可以分化为多种组织细胞
• MSCs也称骨髓基质来源干细胞（bone marrow stroma derived stem cells）
细胞治疗相关法规
《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004 《细胞移植治疗技术管理规范》 《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原
则》2003 《自体免疫细胞（T 细胞、NK 细胞）治疗技术管
理规范》2009 《人体细胞治疗和基因治疗指导原则》FDA 1998
细胞类型
A dendritic cell
来源与分类
• 造血干细胞
• 髓系来源的造血祖细胞和淋巴系来源的造血 祖细胞
• 两种来源的细胞均可发育为浆细胞样树突状 细胞(plasmcytoid DCs, PDCs)和常见树突状 细胞 ( conventional DCs, cDCs)
来源与分类
• DC存在于除脑组织外的各种组织和器官中
对靶组织的致病作用 病理性成分所致的基本病症能得到治疗或经过一
段时间或药物治疗后有明显改善 能恢复受累器官的功能
病理性血液成分去除的方法
手工法 采用多联塑料袋进行血液采集、分离、 还输等过程的方法
血液成分分离机法 应用自动化的血液成分分 离机，在无菌密闭塑料管道系统内完成采血、 离心、成分去除和回输整个工作程序
将血液中的某一种病理性成分去除， 再将其余成分还回去，或同时补充 一定量的置换液，可分为治疗性置 换术和治疗性单采术。
治疗性置换术
• 治疗性血浆置换术（therapeutic plasma exchange, TPE）
• 治疗性红细胞置换术（therapeutic red blood cell exchange, TRCE）
第二节 血液成分单采术
单采血小板 单采血浆 外周血造血干细胞的采集 粒细胞单采术
问题
血液成分去除术与单采术的差异？ 血浆置换术的原理及临床应用？ 常用的血浆置换液有哪些？如何应用？
第三节 细胞治疗
教学目的
熟悉细胞治疗的相关法规及要求
* 《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004） * 《细胞移植治疗技术管理规范》 * 《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》2003 * 《自体免疫细胞（T 细胞、NK 细胞）治疗技术管理规范》2009
• 采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种 异体淋巴细胞增殖的能力
DC的制备
• 经诱导后具有典型的形态特征和表面标志， 如CD83、CD86、HLA-DR等
• 经TNF-α诱导培养后形成成熟DC，可高表达 细胞表面标志，能诱导强烈的同种异体淋巴 细胞增殖反应
DC治疗原理
• DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分 子、共刺激分子
血液成分分离机法
离心式血液成分分离机 膜滤式血液成分分离机 吸附柱式血液成分分离机
抗凝剂
ACD-A百度文库 肝素 ACD-A和肝素混合使用
置换液
晶体溶液 包括生理盐水、林格液、平衡盐液 血浆代用品 包括右旋糖酐、明胶等 蛋白质溶液 包括白蛋白、新鲜冰冻血浆、冷
沉淀和静脉注射用的免疫球蛋白等
PBSC的保存
• 短期保存：细胞浓度<5×107/ml, pH>7.0, 时间<72h
• 冰冻保存：DMSO为保护剂（终浓度 10%），细胞浓度3×107/ml-8×108/ml，程 序降 温，液氮、-80℃
HSCT的临床应用
• 异体移植通过在患者体内建立一种新的、具有正 常功能的造血系统，可以用来治疗骨髓功能损伤、 免疫缺陷或先天造血、代谢异常等疾病
• 干细胞 (Stem Cell, SC)
Human embryonic stem cell colony on mouse embryonic fibroblast feeder layer
免疫细胞
• 免疫细胞，通过它可 以抵抗病毒、细菌、 杀灭肿瘤，保证人体 功能正常和健康
A scanning electron microscope (SEM) image of a single human lymphocyte.
临床输血治疗技术
第一节 治疗性血液成分去除及置换术
教学目的
熟悉血液成分去除术的常用技术及要求 掌握血浆置换术的原理、病例选择、置换液选 择 掌握常见的血液成分单采术
了解 血液成分去除术及单采术的常见不良反应类型 及救治
教学安排
血液成分置换术 血液成分单采术
概述
• TBCE:
熟悉临床常用细胞治疗的细胞制备及质量
* 掌握外周血干细胞采集、保存、运输及质量要求 * 掌握树突状细胞的制备及质量 * 掌握细胞因子诱导的杀伤细胞的制备及质量 * 掌握树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞的制备及质量
了解
– 《人体细胞治疗和基因治疗指导原则》FDA 1998年
教学安排
概述 临床常用的细胞治疗方法、原理及制备
教学安排
• 概述 • 临床常用的细胞治疗方法、原理
及制备 • 开展细胞治疗的条件与要求
概述
• 细胞治疗(cell-based therapies): 指利用某些具有 特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获 取，或/并进行体外扩增、培养等处理后，使其 具有增强免疫、杀灭病原体和肿瘤细胞、促进 组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达 到治疗疾病的目的。
病理性成分的去除效率
1个血浆容量置换，去除约63.2% 2个血浆容量置换，去除约86.5% 3个血浆容量置换，去除约95.0%
血液成分剩余率
1个血浆容量置换，剩余率为36.8% 2个血浆容量置换，剩余率为13.5% 3个血浆容量置换，剩余率为5.0%
病理性血液成分去除原则
血液中含有能被TBCE去除的、明确的病理性成分 病理性成分能充分去除，并能有效地消除或减轻
特点
• 脐血MSCs在不同的培养基中能够向心肌细 胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等分化
• 脐血MSCs可诱导生成神经样细胞，并表达 神经特异性烯醇化酶（NSE）以及其他神 经细胞表面标志
• MSCs在软骨诱导培养基中可诱导培养成具 有软骨细胞特性的细胞
3. 树突状细胞
Dendritic cells in skin
• DC与T细胞结合
TCA
– 治疗性红细胞单采术 – 治疗性白细胞单采术 – 治疗性血小板单采术 – 治疗性外周血造血干细胞单采术
临床应用
TCA 真性红细胞增多症 镰状细胞性贫血 白血病 原发性血小板增多症
不良反应和并发症
低血症 心血管反应 反跳现象 过敏反应 凝血功能异常 穿刺部位血肿
干细胞
• 干细胞，定向分化出多种功能独特的细胞
• 干细胞，修复受损的人体器官组织
Mouse embryonic stem cells with fluorescent marker
干细胞分类
分化潜能：
• 全能型干细胞（Totipotent stem cells） • 多能型干细胞（Pluripotent stem cells） • 单能干细胞也称专能或偏能干细胞（Unipotent
• 成熟DC形态特殊，具有许多树突状或伪足样突起， 表达高水平的共刺激因子和粘附因子
DC的生物学功能
• 抗原提呈作用 • 高水平表达共刺激分子和粘附分子而促进
DC与T细胞的结合 • 调节T、B淋巴细胞分化发育 • 诱导免疫耐受
DC的制备
DC的制备
• 分离外周血单个核细胞，贴壁2h后加入 GM-CSF、IL-4 诱导一定时间（通常714d），观察细胞形态，表面标志
• Cell therapy is the transplantation of human or animal cells to replace or repair damaged tissue.
输血与细胞治疗
• 输血作为一种治疗手 段在临床得到了广泛 的应用，其本身就是 一种广义的细胞治疗， 特别是成分输血的推 广和应用，使人们认 识到针对性输注某一 特定血液细胞或成分 能够更好地达到治疗 的目的
• 经动员后当PBSC达到峰值 • 最佳时间: 白细胞计数在（40-50）×109 /L，
单核细胞比例＞10%为最佳采集时机 • 通常白细胞计数升高到10×109 /L以上，外
周血CD34+细胞＞1%，或CD34+细胞峰值 位于（20-40）×106 /L便可以采集 • 容易采集到108数量级的干细胞
• 经物理、化学或生物因 素的动员，干细胞会大 量释放到循环血液中， 从而外周血中造血干细 胞含量增加数十倍甚至 数百倍
教学安排
概述 临床常用的细胞治疗方法、原理及制备
外周血造血干细胞
• 外周血造血干细胞（peripheral blood stem cell, PBSC）移植
• 通过动员采集外周血中的干细胞进行造血 干细胞移植
• 又称为集落形成单位成纤维细胞（colony forming unites fibroblasts，CFUF）
特点
• 来源：MSCs存在于多种组织中，特别是脐 血来源的MSCs较为原始
• 性能：分化能力强，可在体外进行分离、 培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次 传代扩增仍能保持旺盛功能
特点
• 特征：MSCs不表达或低表达免疫排斥相关 标记，免疫原性低
PBSC移植的特点
• 全自动血液成分分离机从外周静脉血中采 集
• 重建造血快 • 在受者体内植入率高 • 来源方便、移植痛苦少，降低了患者的经
济负担
PBSC的采集
• 常用的造血干细胞动员的方法有：
• 化疗药物（大剂量环磷酰胺）、造血细胞 刺激因子（G-CSF）、化疗药物联合造血 细胞刺激因子
PBSC的采集
• 人外周血中DC细胞仅占单个核细胞的1% 以下，但是这些DC的表型和状态并不相同， 不同来源的DC的发育过程及其功能均有所 不同
特点
• 人体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共 刺激因子和粘附因子，体外激发同种混合淋巴细胞 增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有极强的抗原 吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些 因素刺激时即分化为成熟DC
置换液的选择原则
维持正常血浆容量 补充患者需要成分 凝血异常 抑制病理性成分产生 能大量结合病理性成分 患者临床情况
临床应用
TPE AABB分为四类：
第一类标准的可接受治疗的疾病 第二类可接受辅助治疗的疾病 第三类疗效不定的疾病 第四类研究缺乏效果的疾病
• 特征：免疫缺陷细胞，不须经过严格配对 使用，异体移植无免疫排斥反应或反应较 弱，适宜于不同个体之间的移植
特点
• 脐血MSCs具有“横向分化”或“跨系分化”的能 力，不仅支持造血细胞的生长，还可以在不同诱导 条件下，在体外分化为多种组织细胞
• 运用细胞片技术，将单层的一整片MSCs移植到心 肌梗死后瘢痕组织部位，结果移植薄片逐渐变厚， 新血管形成，移植的细胞有阻止心室壁变薄的趋势， 改善心脏功能
治疗性单采术
• 治疗性单采术, 治疗性血细胞单采术 (therapeutic hemocytes apheresis, TCA)
治疗性红细胞单采术 治疗性白细胞单采术 治疗性血小板单采术 治疗性外周血造血干细胞单采术
生理学基础和作用机制
病理性成分： （1）来自造血系统异常增殖产生的过量或功 能异常的血细胞 （2）来自体内、外原因（直接或间接引起的 含量或功能异常的血浆成分 （3）来自内、外源性毒性物质
stem cells）
造血干细胞
• 造血干细胞 （hematopoietic stem cell, HSC）
造血干细胞
• 造血干细胞移植：指对患者进行全身放疗、 化疗和免疫抑制预处理后，将正常供者或 患者自身的造血干细胞回输到患者体内， 以重建其正常的造血与免疫功能
造血干细胞
• 人的造血干细胞主要分 布在骨髓中，约占1%5%，外周血中不到 0.1%
• 自体移植用来治疗自身免疫性疾病，作为一种基 因治疗的有效手段正在应用于通过对干/祖细胞或 淋巴细胞进行修饰，以纠正代谢缺陷和进行免疫 治疗
2. 间充质干细胞
Mesenchymal stem cell
定义
• MSCs是存在于骨髓中一类非造血干细胞， 在适宜的条件下可以分化为多种组织细胞
• MSCs也称骨髓基质来源干细胞（bone marrow stroma derived stem cells）
细胞治疗相关法规
《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004 《细胞移植治疗技术管理规范》 《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原
则》2003 《自体免疫细胞（T 细胞、NK 细胞）治疗技术管
理规范》2009 《人体细胞治疗和基因治疗指导原则》FDA 1998
细胞类型
A dendritic cell
来源与分类
• 造血干细胞
• 髓系来源的造血祖细胞和淋巴系来源的造血 祖细胞
• 两种来源的细胞均可发育为浆细胞样树突状 细胞(plasmcytoid DCs, PDCs)和常见树突状 细胞 ( conventional DCs, cDCs)
来源与分类
• DC存在于除脑组织外的各种组织和器官中
对靶组织的致病作用 病理性成分所致的基本病症能得到治疗或经过一
段时间或药物治疗后有明显改善 能恢复受累器官的功能
病理性血液成分去除的方法
手工法 采用多联塑料袋进行血液采集、分离、 还输等过程的方法
血液成分分离机法 应用自动化的血液成分分 离机，在无菌密闭塑料管道系统内完成采血、 离心、成分去除和回输整个工作程序
将血液中的某一种病理性成分去除， 再将其余成分还回去，或同时补充 一定量的置换液，可分为治疗性置 换术和治疗性单采术。
治疗性置换术
• 治疗性血浆置换术（therapeutic plasma exchange, TPE）
• 治疗性红细胞置换术（therapeutic red blood cell exchange, TRCE）
第二节 血液成分单采术
单采血小板 单采血浆 外周血造血干细胞的采集 粒细胞单采术
问题
血液成分去除术与单采术的差异？ 血浆置换术的原理及临床应用？ 常用的血浆置换液有哪些？如何应用？
第三节 细胞治疗
教学目的
熟悉细胞治疗的相关法规及要求
* 《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004） * 《细胞移植治疗技术管理规范》 * 《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》2003 * 《自体免疫细胞（T 细胞、NK 细胞）治疗技术管理规范》2009
• 采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种 异体淋巴细胞增殖的能力
DC的制备
• 经诱导后具有典型的形态特征和表面标志， 如CD83、CD86、HLA-DR等
• 经TNF-α诱导培养后形成成熟DC，可高表达 细胞表面标志，能诱导强烈的同种异体淋巴 细胞增殖反应
DC治疗原理
• DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分 子、共刺激分子
血液成分分离机法
离心式血液成分分离机 膜滤式血液成分分离机 吸附柱式血液成分分离机
抗凝剂
ACD-A百度文库 肝素 ACD-A和肝素混合使用
置换液
晶体溶液 包括生理盐水、林格液、平衡盐液 血浆代用品 包括右旋糖酐、明胶等 蛋白质溶液 包括白蛋白、新鲜冰冻血浆、冷
沉淀和静脉注射用的免疫球蛋白等
PBSC的保存
• 短期保存：细胞浓度<5×107/ml, pH>7.0, 时间<72h
• 冰冻保存：DMSO为保护剂（终浓度 10%），细胞浓度3×107/ml-8×108/ml，程 序降 温，液氮、-80℃
HSCT的临床应用
• 异体移植通过在患者体内建立一种新的、具有正 常功能的造血系统，可以用来治疗骨髓功能损伤、 免疫缺陷或先天造血、代谢异常等疾病