细胞破碎与分离设备

仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶 处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
3. 反复冻结-融化法 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化， 反复多次而达到破壁作用。
பைடு நூலகம்
一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内
水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而 破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复 多次。
十二烷基磺酸钠
（2）EDTA螯合剂
主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。
EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁
外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导 致内层膜通透性的增强。
（3）有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。 与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏 水性化合物溶于水溶液。 盐酸胍和脲是常用的变性剂。
高压匀浆器的排出阀
影响匀浆破碎的主要因素： 压力、温度、通过匀浆器阀的次数
不宜采用高压匀浆法的细胞类型。 易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌
含有包含体的基因工程菌
大、中、小型高压匀浆器
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液 体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极 大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
细菌
破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结
构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不
及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母
葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚
糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构 交联的紧密程度和它的厚度；
霉菌
细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外
形完整。 酶溶法的缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。
（2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞 酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 激活剂和细胞代谢途径等。 缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质 的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度 下降。
（1）外加酶法 溶菌酶 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等
常用的溶酶
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受 到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法 破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构 和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌
比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。
该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
非 机 械 法
1.酶溶法（Enzymatic Lysis）
优点： 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、 处理量大。特别适合固体含量大（>10％）的悬浮 液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌 和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度 较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干 度不如加压过滤。
度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 植物细胞
次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物
细胞具有很高的机械强度。
常用破碎方法
分 类 珠磨法 作 用 机 理 固体剪切作用 适 应 性 可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困 难 可达较高破碎率，可大规模操作，不 适合丝状菌和革兰氏阳性菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧 烈，不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离，但释放 率较低，通用性差 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的 产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失 活
2.破碎技术的研究方向
1)多种破碎方法相结合
2)与上游过程相结合
3)与下游工程相结合
固液分离设备
一、过滤
定 义：
在一定的压力差下，利用
多孔性介质截留固液悬浮液
中的固体粒子，进行固液分
离的方法称为过滤。
过滤介质
无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等
成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘
操作前，应将板、框和滤布按前述顺序排列，并转动机
头，将板、框和滤布压紧。操作时，悬浮液在压力下经悬浮 液通道和滤框的暗孔进入框内。滤液分别穿过两侧滤布，沿 板上沟槽流下，汇集于下端，经滤液出口阀流出。然后将滤 框和滤布洗净，重新装合，准备下一次过滤操作。但是，多 数情况滤饼装满后还需洗涤，有时还需压缩空气吹干。所以， 板框式过滤机的一个工作周期包括装合，过滤，洗涤（吹 干），去饼，洗净等过程。过滤和洗涤过程的情况见图。
过滤设备
板框过滤机
板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、
滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。
板框压滤机工作运行的原理：先由液压施力压紧
板框组，料液由中间进入，分布到各滤布之间，通
过过滤介质而实现固、液分离的脱液方法。
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放 线菌、酵母菌和细菌（需预处理）等多种 发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10% 的悬浮液的分离。
第六章
细胞破碎与料液 分离设备
细胞破碎定义
• 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破
坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物 成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的 非分泌型生化物质（产品）的基础。
细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物 细胞壁的组成和结构。
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物 细胞的大规模处理中常采用
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
真空转鼓过滤机
（1）过滤区Ⅰ 当浸在悬浮液内的各扇形格同真空管 路接通时，格内为真空。在转筒外压力差的作用下，滤液 透过滤布，被压入扇形格内，经分配头被吸出。而固体颗 粒在滤布上则形成一层逐渐增厚的滤渣。 （2）洗涤吸干区域Ⅱ 当扇形格离开悬浮液进入此区 时，格内仍与真空管路相通。滤饼在此格内将被洗涤并吸 干，以进一步降低滤饼中溶质的含量。有些特殊设计的转 鼓过滤机上还设有绳索（或布）压紧滤饼或用滚筒压紧装 臵，用以压榨滤饼、降低液体含量并使滤饼厚薄均匀防止 龟裂。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不 适应于对冷冻敏感的生化物质。
2. 渗透压法（Osmotic pressure） 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘 油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶
质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物 质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和 进一步提取。
缺点：
通用性差； 时间长，效率低；
有些化学试剂有毒 。
其他方法
1. X-press法 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利 用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋 在冰中的微生物变形而引起的。
2.化学渗透法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性
剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或
膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择
地渗透出来。
（1）表面活性剂
表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作 用有助于细胞的破碎。 Triton X-100 牛黄胆酸钠
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、
Braun匀浆器；
中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国 西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
胶体磨
德国进口珠磨机
结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。
非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维 滤布、短纤维滤布。 金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。 无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。
过滤设备的分类
根据推动力的不同可分为四类 • 重力过滤 • 加压过滤 • 真空过滤 • 离心过滤 自然过滤 板框过滤 真空过滤器 离心过滤器
4.干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1) 直接测定法（革兰氏染色法）
2) 目的产物测定法
3) 导电率测定法
（3）卸渣区Ⅲ 这个区与分配头的Ⅲ室相接通，在Ⅲ 室通入压缩空气，压缩空气促使滤饼与滤布分离，然后将滤 饼清除。 （4）滤布复原区Ⅳ 滤渣被刮落后，为了除去堵塞在 滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气通过分配头的Ⅳ室进入复 原区的滤室，吹落这些颗粒使滤布复原，重新开始下一循环 的操作。 因为转鼓不断旋转，每个滤室相继通过各区即构成了连 续操作的工作循环。而且在各操作区域之间，都有不大的休 止区域。
机 械 法
高压匀浆 法 超声破碎 法 X-press法
酶溶法
液体剪切作用
液体剪切作用
固体剪切作用
酶分解作用 改变细胞膜的渗透 性 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性
非 机 械 法
化学渗透 法 渗透压法 冻结融化 法 干燥法
机 械
法
1.珠磨法（Bead mill）
原理： 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英 砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅 拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、 碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器 的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而 实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷 却的方式带走。
生物类型 G+细菌 G-细菌 酵母菌 霉菌 植物细胞 初生壁 次生壁 肽聚糖 肽聚糖 葡聚糖 多聚糖（几 （40-90%） （5-10%） （30-40%） 丁质） 多糖 脂蛋白 甘露聚糖 （80-90%） 主要组成 胞壁酸 脂多糖 （30%） 脂类 蛋白质 （11-22%） 蛋白质 蛋白质 脂多糖 磷脂 （6-8%） （1-4%） 蛋白质 脂类 （8.513.5%）
滤板与滤框的工作情况
优点： 结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较 大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和 洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围
广。
缺点：
设备笨重、占地面积多、辅助时间长、生产效率
低。
板框过滤机
在滤板的外缘有一个钮的称为过滤板，三个钮的称为洗 涤板，在滤框的外缘铸有两个钮。从图8-2可以看出，1是过 滤板，2是滤框，3是洗涤板。板和框是按照钮的记号1-2-32-1····的顺序排列的。 滤板和滤框的构造如图所示。滤板表面上有棱状沟槽， 其边缘略微突起。在板、框和滤布的两个角都有小孔，它们 组合并压紧后即构成了供滤液和洗涤水流通的孔道。框的两 侧覆以滤布，空框和滤布围成了容纳滤浆和滤饼的空间。滤 板的作用有二：一是支撑滤布；二是滤液流出的通道。