细胞破碎与分离设备

细菌
破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结
构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不
及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母
葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚
糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构 交联的紧密程度和它的厚度；
霉菌
细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强
操作前，应将板、框和滤布按前述顺序排列，并转动机
头，将板、框和滤布压紧。操作时，悬浮液在压力下经悬浮 液通道和滤框的暗孔进入框内。滤液分别穿过两侧滤布，沿 板上沟槽流下，汇集于下端，经滤液出口阀流出。然后将滤 框和滤布洗净，重新装合，准备下一次过滤操作。但是，多 数情况滤饼装满后还需洗涤，有时还需压缩空气吹干。所以， 板框式过滤机的一个工作周期包括装合，过滤，洗涤（吹 干），去饼，洗净等过程。过滤和洗涤过程的情况见图。
2.破碎技术的研究方向
1)多种破碎方法相结合
2)与上游过程相结合3ຫໍສະໝຸດ 与下游工程相结合固液分离设备
一、过滤
定 义：
在一定的压力差下，利用
多孔性介质截留固液悬浮液
中的固体粒子，进行固液分
离的方法称为过滤。
过滤介质
无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等
成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶
质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物 质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和 进一步提取。
缺点：
通用性差； 时间长，效率低；
有些化学试剂有毒 。
其他方法
1. X-press法 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利 用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋 在冰中的微生物变形而引起的。
真空转鼓过滤机
（1）过滤区Ⅰ 当浸在悬浮液内的各扇形格同真空管 路接通时，格内为真空。在转筒外压力差的作用下，滤液 透过滤布，被压入扇形格内，经分配头被吸出。而固体颗 粒在滤布上则形成一层逐渐增厚的滤渣。 （2）洗涤吸干区域Ⅱ 当扇形格离开悬浮液进入此区 时，格内仍与真空管路相通。滤饼在此格内将被洗涤并吸 干，以进一步降低滤饼中溶质的含量。有些特殊设计的转 鼓过滤机上还设有绳索（或布）压紧滤饼或用滚筒压紧装 臵，用以压榨滤饼、降低液体含量并使滤饼厚薄均匀防止 龟裂。
4.干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1) 直接测定法（革兰氏染色法）
2) 目的产物测定法
3) 导电率测定法
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不 适应于对冷冻敏感的生化物质。
2. 渗透压法（Osmotic pressure） 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘 油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。
度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 植物细胞
次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物
细胞具有很高的机械强度。
常用破碎方法
分 类 珠磨法 作 用 机 理 固体剪切作用 适 应 性 可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困 难 可达较高破碎率，可大规模操作，不 适合丝状菌和革兰氏阳性菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧 烈，不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离，但释放 率较低，通用性差 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的 产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失 活
优点： 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、 处理量大。特别适合固体含量大（>10％）的悬浮 液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌 和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度 较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干 度不如加压过滤。
（3）卸渣区Ⅲ 这个区与分配头的Ⅲ室相接通，在Ⅲ 室通入压缩空气，压缩空气促使滤饼与滤布分离，然后将滤 饼清除。 （4）滤布复原区Ⅳ 滤渣被刮落后，为了除去堵塞在 滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气通过分配头的Ⅳ室进入复 原区的滤室，吹落这些颗粒使滤布复原，重新开始下一循环 的操作。 因为转鼓不断旋转，每个滤室相继通过各区即构成了连 续操作的工作循环。而且在各操作区域之间，都有不大的休 止区域。
高压匀浆器的排出阀
影响匀浆破碎的主要因素： 压力、温度、通过匀浆器阀的次数
不宜采用高压匀浆法的细胞类型。 易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌
含有包含体的基因工程菌
大、中、小型高压匀浆器
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液 体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极 大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。
非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维 滤布、短纤维滤布。 金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。 无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。
过滤设备的分类
根据推动力的不同可分为四类 • 重力过滤 • 加压过滤 • 真空过滤 • 离心过滤 自然过滤 板框过滤 真空过滤器 离心过滤器
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物 细胞的大规模处理中常采用
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、
Braun匀浆器；
中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国 西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
胶体磨
德国进口珠磨机
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外
形完整。 酶溶法的缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。
（2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞 酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 激活剂和细胞代谢途径等。 缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质 的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度 下降。
机 械 法
高压匀浆 法 超声破碎 法 X-press法
酶溶法
液体剪切作用
液体剪切作用
固体剪切作用
酶分解作用 改变细胞膜的渗透 性 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性
非 机 械 法
化学渗透 法 渗透压法 冻结融化 法 干燥法
机 械
法
1.珠磨法（Bead mill）
原理： 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英 砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅 拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、 碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器 的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而 实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷 却的方式带走。
生物类型 G+细菌 G-细菌 酵母菌 霉菌 植物细胞 初生壁 次生壁 肽聚糖 肽聚糖 葡聚糖 多聚糖（几 （40-90%） （5-10%） （30-40%） 丁质） 多糖 脂蛋白 甘露聚糖 （80-90%） 主要组成 胞壁酸 脂多糖 （30%） 脂类 蛋白质 （11-22%） 蛋白质 蛋白质 脂多糖 磷脂 （6-8%） （1-4%） 蛋白质 脂类 （8.513.5%）
影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌
比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。
该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
非 机 械 法
1.酶溶法（Enzymatic Lysis）
2.化学渗透法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性
剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或
膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择
地渗透出来。
（1）表面活性剂
表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作 用有助于细胞的破碎。 Triton X-100 牛黄胆酸钠
滤板与滤框的工作情况
优点： 结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较 大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和 洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围
广。
缺点：
设备笨重、占地面积多、辅助时间长、生产效率
低。
板框过滤机
在滤板的外缘有一个钮的称为过滤板，三个钮的称为洗 涤板，在滤框的外缘铸有两个钮。从图8-2可以看出，1是过 滤板，2是滤框，3是洗涤板。板和框是按照钮的记号1-2-32-1····的顺序排列的。 滤板和滤框的构造如图所示。滤板表面上有棱状沟槽， 其边缘略微突起。在板、框和滤布的两个角都有小孔，它们 组合并压紧后即构成了供滤液和洗涤水流通的孔道。框的两 侧覆以滤布，空框和滤布围成了容纳滤浆和滤饼的空间。滤 板的作用有二：一是支撑滤布；二是滤液流出的通道。