水分子与蛋白质分子的相互作用

水分子与蛋白质分子的相互作用

姚瑶1赵林1,2*

(天津大学1化工学院2环境学院天津 300072)

摘要水是一种不同寻常的液体，它的特殊性使它作为生命的基质起着独一无二的作用。目前，对于蛋白质内部和周围的水分子的研究，表明水在蛋白质结构和功能中扮演的至关重要的角色。尽管目前

还没有得到明确的水分子的生物学作用，但通过三种现代结构研究的关键技术——结晶学、核磁共振光谱

学和计算机分析模拟方法的结合，已经取得了一些结果。本文从实验研究和理论模拟两方面，总结了水分

子与蛋白质分子间的相互作用的研究进展，阐述了水分子对蛋白质结构、稳定性的影响，并展望了从水分

子角度出发来研究蛋白质性质的前景。

关键词水分子蛋白质分子结构稳定性

Interaction of Water with Protein

Yao Yao1, Zhao Lin1,2*

(1College of Chemical Engineering, 2College of Environment, Tianjin University, Tianjin 300072)

Abstract Water is a profoundly unusual liquid, and its peculiarities may make it uniquely suited to act as life’s matrix. Recent studies of water in and around proteins have made us acutely aware of the critical role that water plays in protein structure and function. Although we do not yet have definitive biological effect of water, a consensus is emerging, which brings together the three key techniques of modern structural research: crystallography, NMR spectroscopy, and computer methods of analysis and simulation. This paper summarized the progresses of the interaction of water molecule and protein molecule researched in both experiment and theoretical simulation. The influence of water molecule on the protein molecular structure and stability were expatiated. Prospects of the research about protein considered the influence of water were predicted.

Key words Water, Protein, Structure, Stability

水是地球上存在数量最多的分子化合物，生物体的组成成分中，水的含量最高。水分子具有极性，能通过静电吸引与周围的水分子形成四个氢键，构成四面体结构。水分子既是质子供体又是质子受体，能够通过氢键与蛋白质的极性部位或非极性部位结合，影响蛋白质的结构以及生物学功能。事实表明[1~6]，水在生命大分子的结构及活性方面起着非常特殊的作用，因此，水分子的生物学作用[7]引起了人们的广泛关注。但是由于实验仪器和研究方法的局限，水分子与生物大分子的相互作用难于观察,水分子的生物学功能尚不十分明确。众所周知，蛋白质动力学和水分子的动力学密切相关[8]。因此，有必要深入了解水分子与蛋白质分子之间的相互作用。本文从实验和模拟两方面总结了近年来国内外水分子与蛋白质分子的相互作用的研究情况，讨论了水分子对蛋白质构象、稳定性的影响，并展望了从水分子角度出发研究蛋白质性质的前景。

1 实验研究

自然界中没有真空环境，水分子会尽力填补蛋白质所不能到达的空缺。但是与蛋白质相比较，

姚瑶女，24岁，硕士生，现从事水分子蔟结构对生物大分子的影响研究。*联系人，E-mail: zhaolin@https://www.360docs.net/doc/6217722793.html,

国家重大基础研究前期研究专项(2003CCA04300)和国家自然科学基金资助项目(20376054)

2005-11-29收稿，2005-12-19接受

水分子非常小，试验观察仍存在一定难度。研究蛋白质与水分子相互作用的实验方法主要有NMR 法、X射线衍射法、中子散射法以及红外光谱法。

1.1 晶体结构中的水分子

蛋白质分子与水分子通过氢键相结合，并非使蛋白质的结构更加紧密，刚性变大，而是增加了蛋白质的弹性，使其结构更加稳定。X射线衍射法是最先给出晶体状态蛋白质的具体原子结构信息的方法。Nakasako认为，在溶液中有着四面体氢键几何结构的水分子在蛋白质表面仍保持该结构并使其三维链伸入到含有水合水分子和极性原子的蛋白质内部，形成氢键网络。氢键网络富有弹性，可适应蛋白质构象的变化，例如局部运动[9]。Takano[10]研究了Ala(丙氨酸)/Gly(甘氨酸)突变的人溶解酶去水合过程，发现水分子与空穴体积大的蛋白质结合的稳定性较大，认为蛋白质内部空穴中水分子的存在对蛋白质的稳定性有利。

中子散射实验也同样得到了关于水分子与不同生物分子间相互作用的信息。Michalarias将水分子动力学模拟的优势与表面结合水中子散射实验相结合,区分了蛋白质表面结合水分子与容积水，得到了DNA、光合体系Ⅱ、胰凝乳蛋白酶周围水分子的性质[11]。实验结果表明，与DNA紧密结合的水分子的动力学与相同温度下高密度无定型态冰相似。如图1所示，高水合值下在28、38和67meV 处有尖峰，表1中显示28.4和37.9为氢键的振动峰，然而，在低水合时这一性质却完全消失。图2所示，降低干DNA或干蛋白质的含量后，在低水合条件下，水的谱线与冰Ⅰh的极为相似。

图1干燥和水合蛋白质的TOSCA校正谱图Fig.1Dry and hydrated DNA measured on the updated

TOSCA spectrometer

顶端曲线为冰Ⅰh谱图

图2减少干燥膜或DNA含量后得到水合膜和水合DNA

界面水的估算谱图

Fig.2Estimation of the interfacial water in hydrated

membranes and hydrated DNA

表1 TOSCA谱图中峰值分布

Tab.1Assignment of the peaks in the TOSCA spectra

能量/meV TOSCA公认的振动

7.1 声子相关区域

10 声子相关区域

28.4 弱氢键

37.9 强氢键

22~40 CH3扭转

67 氢键振动带左边缘

50~65 结合蛋白质骨架和两平面转换

121 氢键振动带右边缘

90~140 CH3-r, CH2-r, NH-ip, NH-op, NH2-b, NH2-r

145~190 CH-b, CH2-b, CH2-w, CH2-tw, CH3-sb, CH3-ab, 氨基化物II and III (NH-ib连接于C-N键) Pertsemlidis等[12]结合中子散射实验和分子动力学模拟分析了水分子如何与NALA分子内部相

结合以及在蛋白质稀溶液中溶剂与溶剂是如何相互作用的。

红外光谱法[13]也是一种可以揭示水分子与生物大分子间的氢键网络结构的实验方法，但是它必须是由受噪声影响很小的、基于干涉测量法的光谱完成，这就是所谓的FTIR(傅立叶变换红外光谱)。不过普通的FTIR在研究中也会遇到许多困难，如大量水的背景峰等。

随着科技的不断发展，实验仪器精度不断提高，水分子与蛋白质分子相互作用的实验研究也将取得更多的突破。

1.2 蛋白质溶液中的水分子

NMR法[14]已成为和X射线晶体衍射法相互独立而又互补的结构分析方法。X射线衍射法给出静态信息，NMR可以研究动力学性质[15]、热力学信息[16]、分子结构信息[17~22]、分子动态信息[23,24]。一些研究[25~28]发现蛋白质溶液三维结构与蛋白质晶体结构中的水分子的性质是大致相同的。

Bertini等[17]用1H NMR谱研究了氧化态马心脏细胞色素C的水合性质,用二维同核 Ephogsy-Noesy实验描述了水分子与蛋白质分子的相互作用。NOE效应揭示了不可交换的蛋白质质子与水分子质子的相互作用。Niccolai等[19]用NMR通过水与蛋白质的Overhauser效应和顺磁性混乱的轮廓联合分析研究了两个结构明确的蛋白质Tendamistat(淀粉酶抑制剂)和BPTI(牛胰岛素抑制剂)的表面可接近度,并发现了蛋白质表面覆盖的有序水分子网络的位置。Nerinovski等[20]用17O NMR驰豫方法研究了细胞色素中水-蛋白质的相互作用。Lesage等[21]用1H、13C固体NMR研究微晶Crh中水与蛋白质相互作用。Rossi等[22]用选择性NMR驰豫研究了水-蛋白质和配位体-蛋白质的相互作用，该作用是由大分子存在于水和配位基NMR选择性和非选择性自旋晶格驰豫速度所导致。

Kihne等[18]用1H自旋晶格驰豫原理解释了牛血清白蛋白(BSA)与水分子间的相互作用。他们认为高频率区的谱线归因于与蛋白质结合的水分子的运动或在1ns时间尺度上蛋白质分子内部的运动，并且区分了分子间驰豫和分子内驰豫。如图3所示，A为溶于D2O的样品，与空气(21(vol)%O2)平衡后测定的弛豫数据。这个弛豫分布曲线有两个明显的分布平台。低Larmor频率处的分布曲线发生在1.3MHz，与大分子蛋白质的42ns转动相关时间相对应。高频分布曲线发生在大约20MHz，对应于蛋白质内部运动、结合水分子的运动或顺磁性电子自旋的弛豫。B为与1atm 100%O2相平衡样

图3pH=7.0, 室温294±1K浓度为1(w/v)% BSA水溶液中质子的1H自旋晶格驰豫率常数

Fig.3 1H spin-lattice relaxation rate constants for protons in aqueous solutions containing 1(w/v)% BSA at pH=7.0 and ambient laboratory

temperature of294±1K

品的弛豫谱图，这里，高频分布明显增大。因此他认为A中高频分布产生的原因是质子-氧原子-电子偶极耦合导致的自旋-晶格弛豫。C为BSA稀D2O溶液平衡于100%N2的弛豫数据，在低频部分，它完全为单一分布；高频分布明显减少，但并未完全消失。D为水溶液平衡于1atm 100%N2的蛋白质样品的谱图。从这两张无氧存在的磁弛豫分布曲线可以看出，它们可能符合简单Lorentzian分布，在H2O溶剂和D2O溶剂中，蛋白质转动相关时间分别为41±3ns和51±4ns。比较C和D这两张图，可以区分分子内和分子间偶极作用对弛豫的贡献的相对大小。

Modig等[15]用2H、17O核磁驰豫消散MRD法研究环状缩氨酸oxytocin的水溶液和深度过冷溶液中的球状蛋白质BPTI，揭示了这些生物分子表面水合层中水的动力学详细特点。生物大分子表面结合水分子与容积水相比，约95%没有运动产生的两个延迟的折叠结构，而且BPTI表面暴露的非极性残基并未诱导产生窗格状疏水水合结构。他还指出水-蛋白质NOE效应在长程范围偶极与容积水的相互作用中占主要地位。Pagnotta等[16]研究了渗透的水蛋白质系统的玻璃态行为。

Gruschus等[24]用NMR定量测定了在蛋白质表面水分子扩散的存在时间。该存在时间是用ROE 的比率和水与蛋白质骨架、侧链氨基酸的NOE交互驰豫率计算来得到的。Denisov等[23]从水分子渗透作用和构象改变的角度研究了蛋白质内部结构的稳定性。他指出，埋藏于非极性内部区域的可电离侧链会使蛋白质结构变得不稳定，并有可能由于pH的改变引发构象的变化。

除核磁共振法之外，文献中还介绍了光谱分析[29~32]、热分析[33,34]等方法。

Nilesen等[26]用拉曼光谱研究了水分子的结构以及水分子与蛋白质分子相互作用的特点。氢键结合水分子表现在，低频波段180cm-1附近有一最高峰出现。Khoshtariya等[31]用不同的O-H(D-H)振动光谱研究了水合BSA蛋白质的界面渗透网络以及高度可极化的水-水氢键。数据表明有两种非常宽的OH(OD)亚键位于3260和2840cm-1(对于OD，相应的在2350和2050cm-1)。这些键被指认为是水分子的伸缩振动，包括强蛋白质-水和水-水氢键。Kim[32]用激光衍射法研究了蛋白质浓度对β-乳球蛋白乳状液的影响。

Kiyoshi[33]检测球蛋白分子中存留的少量水在低温下的热行为，发现含水BSA的热容略大于水分子的热容，且有自发放热和吸热作用。他认为BSA中遗留的少量水是造成低温下的现象产生的原因。Dzwolak等[34]用FT-IR、DSC/PPC研究了单体牛胰岛素聚合过程中蛋白质水合状态与聚合物构象特点的关系，胰岛素的聚合可能是由于疏水作用驱动的，也可能包括疏水侧链氨基酸残基的重组。

2 理论计算和动力学模拟

水分子在生物大分子的结构、稳定性和功能方面起了关键作用。然而，系统周围水分子层非常薄，厚度只有1~3个分子层。因此，对于水合层的研究非常困难。介电弛豫法研究了整个系统的整体响应，但是对结合水的动力学并不敏感。NMR技术(NOE和NMRD)拥有必需的空间解决能力，但是也缺少动力学研究能力。中子散射技术开始是用于研究系统中水合层的动力学，能很好地解决动力学问题，但是它只能提供整体响应。在这种情况下，计算机模拟在理解结合水的性质方面起到了重要作用。许多研究[35]应用MD模拟探索蛋白质溶液中界面水分子的动力学性质，常用的还有Monte Carlo法、基于分子轨道理论的从头计算法、密度函数理论等。事实证明分子动力学模拟足以完成蛋白质与水分子的动力学[36~39]、热力学[40]模拟以及生物活性与水分子动力学之间的相互关系的研究。

水分子与蛋白质表面相结合形成水合层，水合层中结合水的性质与容积水的性质是不同的。结合水物理性质的特征对于理解蛋白质的结构和折叠是重要的。Yuichi[41]指出蛋白质折叠受到水分子热运动的影响，水的熵变过程中产生了强大的推动力，它导致蛋白质折叠过程中构象熵大大减少。

Smith[42]用分子动力学模拟显示第一水合层的密度变化由蛋白质表面的静电学性质以及该处表面的

形态决定。他们检验了与蛋白质结合具有规则排列结构的水分子的热力学，应用普遍模式分析，计

算了与牛胰岛素抑制剂晶相结构规则排列的水分子的振动熵变。该复杂的振动熵比非结合蛋白质的

振动熵高出17.6 J/(mol·K)。Dellerue S[43]用类弹性中子散射的方法研究了高浓度下C-藻青蛋白表面

水分子的弛豫动力学。计算结果表明，平均扩散系数低于容积水的十分之一，证实了水分子在蛋白

质表面的延迟，也与亲水模型表面水分子的结果相一致。

Balasubramanian[44]用分子动力学模拟一种有13个氨基酸残基的小分子蛋白质，实验结果揭示

在水合层临近的水的动力学整体上减慢了，但是水分子在第二个β转角处即活性位附近表现为比附

近蛋白质区域较快的动力学。如图4所示，β2片段附近水分子表现为比第一和三片段更快的适应偶

极再定位的能力。从表2中可以看到在第一个和第三个蛋白质片段附近的水分子表现为很慢的动力

学，大约为数百皮秒，由于数据限制无法定量。这一现象可能是由与该片段特定残基通过氢键联结

的水分子所引起。我们还可以观察到第二个片断周围水分子的偶极再定位平均时间常数高于容积水

很多，这可能是由于特定的、最接近的残基与蛋白质局部几何结构相互作用导致的。由于该β转角

被认为是在蛋白质感受器捆绑中起关键作用，β转角处水分子的较快动力学可能有生物学重要性。

图4蛋白质的三个片断中水分子偶极再定位时间相关函数Cμ(t)

Fig.4 Reorientational time correlation function of the water dipole Cμ(t) for water molecules in the three segments of the protein.

表2与容积水相比较，不同蛋白质片断附近水分子的偶极再定位时间相关函数的多指数拟合参数

Tab.2 Parameters of multi-exponential fit to the dipole reorientational time correlation functions of water molecules near different segments

of the protein, compared with that for water in bulk.

片断 时间常数/ps 振幅/% <τμ>/ps

β1，β30.32 22.4 -

4.18 61.4

长时间16.2 β20.06 11.6 5.6

1.97 48.2

11.44 40.2

容积水TIP3P0.27 20.2 2.0

2.43 79.8

Smolin[45]用分子动力学模拟了葡萄球菌核酸酶表面的水分子密度函数，分析了其结构性质。研

究表明第一水合层平均密度大于容积水0.3%～0.6%。室温(300K)下，氢键结合水网络紊乱扩展至蛋

白质表面二至三个水合层，水的密度函数的第一个峰出现在极性分子N、O附近，第二个峰的位置

与非极性分子C附近的水相一致；侧链C原子第一水合层与极性侧链键合骨架原子以一或二个氢键

相键合，存在水环簇。还发现水环在4-6AA处，垂直结合于蛋白质表面。

Levstik[46]对水合蛋白质用介点松弛进行了研究，发现了典型的蛋白质玻璃态行为。Peyard等[47]用最小蛋白质模型研究了水合蛋白质的玻璃态转变效应后指出，如果考虑到与蛋白质表面相结合，在最小模型中存在一个玻璃态行为。他还运用统计力学和“二维水分子”模型的动力学[48]，描述了结合水分子氢键的排列，讨论了结合水动力学与介电常数测量得到的蛋白质表面的电荷传递之间的联系。Tournier等[49]用实验和计算模拟相结合的方法发现一种玻璃态的转变存在于低于200K的水和蛋白质的内部动力学中，结果表明，蛋白质的转换由结合水的动力学转变驱动，它也导致主要发生在蛋白质外部结构侧链上的波动增加。

如前所述，实验已经证明了蛋白质结合水的存在增加了蛋白质的弹性，分子动力学模拟也证明了同样的结论。Fischer[50]对BPTI的计算分析显示蛋白质实际上变得更柔软了，振动熵增加了，并且指出稳定一个单个水分子所需要的大量熵消耗[-T△S=86.1kJ/mol对于平动转动自由度的减少]只可由水-蛋白质相互作用部分来补偿。Olano[51]进行了水分子从纯液体向蛋白质内部空穴位转移的自由能计算。选取了不同的水分子环境：一个是极性形成四个水-蛋白质氢键，一个是更疏水仅形成一个水-蛋白质氢键，计算得到了不同空穴具有非常不同的自由能，只有极性BPTI空穴是亲水的，结果显示向极性空穴转移是熵减的，而向非极性空穴转移是熵增的，从蛋白质原子处的混乱程度看，加入水分子使蛋白质更有弹性，这增加的弹性是由于增加了空穴附近蛋白质-蛋白质氢键的长度，减小了键能。Pedersen[52]研究了水分子网络和apo酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性位弹性。

氢键已被认为是蛋白质折叠的立体化学序列的一部分，蛋白质折叠为唯一的三维结构，因此，这些氢键被认为是稳定的。Cao等[53]计算蛋白质X射线晶体结构中的每个单个氢键被破坏的可能性。结果表明58%的这些氢键被发现有较低的破坏的可能性(-7.5kJ/mol)。蛋白质表面极性或荷电部分与水分子之间的氢键是一个蛋白质水合的关键因素，Degrève[7]解释了水分子在保持缩氨酸结构中的重要作用。Petukhov[54]用一个可接近表面积(ASA)模型对水-蛋白质氢键在假定蛋白质构象的有效性进行了估算。水分子转动/振动运动产生的蛋白质-水氢键的转变对于允许蛋白质结构弛豫是不够的，平动替代运动产生的蛋白质结合水分子的完全转换发挥着更重要的作用[55]。Jensen[56]用分子动力学模拟了水分子与通道之间的渗透和静电学相互作用，在它的模拟中发现水分子键的破坏并不是水溶液中质子排除的机理。Shanthi[57]用交互式网络软件——WAP水分析软件，计算水中氧原子与蛋白质原子间距离。Rocha[58]用Monte Carlo法研究了在蛋白质折叠问题中水分子的因素。

3 前景展望

水分子具有的重要的生物学功能，受到了科学界的广泛关注，实验和分子动力学模拟都能够很好的揭示水分子与蛋白质相互作用的结构、动力学、热力学等特点，但是由于受到目前实验方法、硬件设备精度和人们对水分子的认识等的局限性，水分子的生物学功能还不完全明确，此研究有待进一步的深入。此外，水分子对于生物大分子的结构有着重要的作用，改变水分子的微观结构是否能够改变生物大分子的结构和功能，如何能够使水分子与蛋白质等生物大分子的氢键作用从蛋白质表面深入蛋白质结构内部，改变水分子的结构是否会带来生物大分子三维结构的改变，这些将是我们今后研究的课题。随着科技的进步和知识的积累，对于水分子，这一广泛存在却又神秘莫测的物质，我们必将取得更多的研究成果。

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