RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
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Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
酶Redα /Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同 源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
酶Redα /Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同 源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。