老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生(一)

老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生(一)

作者：蔡建春，刘棣，刘凯华，张海萍，钟山，夏宁邵

【关键词】癌,鳞状细胞；食管肿瘤,腺癌；微卫星重复；聚合酶链反应；barrett食管；化生；增生；序列分析

摘要:目的评估老年人食管鳞状细胞癌(ESCC)、食管腺癌(EADC)和Barrett化生不典型增生腺癌序列DNA微卫星的改变。方法应用稀释性PCR技术检测老年人ESCC、EADC和Barrett化生不典型增生腺癌序列中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S617个位点DNA微卫星的改变。结果在非稀释DNA中，23例老年人ESCC和18例老年人EADC 微卫星不稳定性(MSI)的频率分别是47.8%(11/23例)和38.9%(7/18例)，杂合性丢失(LOH)的频率分别是26.1%(6/23例)和16.7%(3/18例)，两者的MSI或LOH频率比较没有显著差别（P＞0.05）。在稀释DNA中，8例老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生异型增生腺癌序列的MSI和LOH频繁出现，尤其在D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点上，与非稀释DNA的MSI和LOH频率相比有显著差别（P＜0.05）。结论老年人ESCC和EADC微卫星改变没有差别。老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生异型增生腺癌组织DNA的MSI和LOH普遍存在，它们可能是EADC发生发展的早期分子事件，D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点的微卫星改变可能在此过程中起着重要作用。

关键词:癌，鳞状细胞；食管肿瘤，腺癌；微卫星重复；聚合酶链反应；barrett食管；化生；增生；序列分析

Barrett食管发生腺癌危险性是一般人群的125倍，其中间过程是柱状化生上皮向不典型增生上皮转化，称之为Barrett化生不典型增生腺癌序列12]。食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EADC)是老年人的常见病。老年人反流性食管炎合并的Barrett食管比年轻人的更易发生不典型增生和腺癌3]。为了更好地了解老年人ESCC和EADC的发生发展过程，笔者检测了ESCC、EADC、正常食管鳞状上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列组织中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S617个位点DNA微卫星的改变。

1材料与方法

1.1病例人与标本选自福建医科大学附属厦门第一医院病理科2002年3月～2005年10月存档手术切除食管癌石蜡标本41例，患者年龄（68.2±9.6）岁（60～80.5岁）；术前未经过化疗和放疗，标本经福建医科大学附属厦门第一医院伦理委员会批准收集。进行常规组织切片,HE染色和病理诊断。组织病理学分析：23例ESCC，18例EADC，其中8例EADC在癌组织旁同时存在Barrett化生和不典型增生上皮。由2位病理医师进行组织病理学分析并核对。

1.2组织病理学分析、显微切割、DNA提取和DNA稀释先行常规组织切片、HE染色和组织病理学分析，在显微镜下标记所要切割的组织区域。再切厚度为10μm的组织3片，在显微镜下按照HE染色切片上的标记进行显微切割，取出组织，装入0.5mL离心管。余下蜡块组织再行常规切片、HE染色并与切割前的切片比较（图1）。切割不同蜡块时均清洁石蜡切片机刀头和刀片，显微切割不同组织均用不同的洁净器械。采用蛋白酶K （10mmol/LTrisHCl,pH8.0,100mmol/LKCl,

2.5mmol/LMgCl2,0.45%Tween20，2.5mg/mL蛋白酶K）消化方法提取基因组DNA：组织在50μL蛋白酶K消化液中95℃变性10min，常温冷却1h，然后在65℃孵育1h，最后在95℃变性10min去除多余的蛋白酶K，混合物离心（5000r/min，5min），吸出上清液，移至洁净的离心管。DNA质量测定值在 1.0723～1.2401D(260nm)/D(280nm)],DNA含量为255.36～406.98ng/μL。8例正常鳞状上皮、Barrett 化生上皮、不典型增生上皮和EADC组织的DNA分别按1∶100，1∶1000，1∶5000，1∶10000和1∶50000稀释度用三蒸水进行稀释。

1.3稀释性PCR和微卫星改变7个微卫星位点是D2S123，D3S1616，D3S1300，BATRⅡ，D5S346，D17S787和D18S61（PCR引物购自美国ResearchGenetics公司），分别位于hMSH2，hMLH1，

FHIT和TGFβRⅡ基因内，MCCAPC基因之间以及p53和DCC基因邻近。每个不同稀释度（1∶100，1∶1000,1∶5000,1∶10000，1∶50000）的PCR扩增反应均包含1μLDNA模板，0.4μCi:r32P]ATP放射性标志的微卫星引物，0.2mmol/LdNTP,10mmol/LTrisHCl,pH8.3,1.5mmol/LMgCl2,50mmol/LKCl和0.4U的Taq多聚酶，反应总体积为10μL。PCR反应条件为：95℃5min→95℃30s→58℃40s→72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸2min。

A:切割前;B:显微切割后.

图1Barrett食管不典型增生上皮(HE染色×200)（略）

Fig1EpithelialdysplasiainBarrettesophagus(HEstaining×200)

图1Barrett食管不典型增生上皮(HE染色×200)（略）

1EpithelialdysplasiainBarrettesophagus(HEstaining×200)

图2Barrett食管不典型增生上皮被显微切割后(HE染色×200)（略）

Fig2Epithelialdysplasiaaftermicrodissection(HEstaining×200)

PCR引物序列如下：

D2S123上游引物：5’ACATTGCTGGAAGTTCTGGC3’

D2S123下游引物：5’CCTTTCTGACTTGGATACCA3’

D3S1616上游引物：5’CTCCCTACCTGAAAAGATGC3’

D3S1616下游引物：5’TCGGCTTAAAGACTCAGTTTATT3’

D3S1300上游引物：5’AGCTCACATTCTAGTCAGCCT3’

D3S1300下游引物：5’GCCAATTCCCCAGATG3’

BATRII上游引物：5’CTTTATTCTGGAAGATGCTGC3’

BATRII下游引物：5’GAAGAAAGTCTCACCAGGC3’

D5S346上游引物：5’ACTCACTCTAGTGATAAATCGG3’

D5S346下游引物：5’GTTTCCATTGTAGCATCTTGAC3’

D17S787上游引物：5’NEDTGGGCTCAACTATATGAACC3’

D17S787下游引物：5’TTGATACCTTTTTGAAGGGG3’

D18S61上游引物：5’ATTTCTAAGAGGACTCCCAAACT3’

D18S61下游引物：5’ATATTTTGAAACTCAGGAGCAT3’

对同一个稀释度DNA标本均进行多次PCR检测，PCR产物用亚甲蓝加样缓冲液按1∶1稀释，该缓冲液包含95%亚甲蓝，0.05%溴芬蓝，0.05%埃先蓝和20mmol/LEDTA。5μL的PCR产物与2μL变性染料混匀后在7%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2～4h，凝胶在真空干燥机80℃干燥后，用Kodak胶片（美国Kodak公司）曝光6～24h。