选择性荧光探针分析PPT课件
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基于激基缔合物设计的荧光分子探针
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荧光分子探针的特点
Ø荧光探针的荧光必须与生物样品的背景荧光易于区别; Ø荧光探针必须不干扰研究的主体; Ø荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面 都有严格的要求。 目前使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类，香豆 素类等化合物。
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罗丹明类
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4、激基缔合物/复合物
如果两个相同的荧光团之间的位置和距离合适，其中一个荧光团被激发以后 就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物(excimer)，其荧光发射光谱 的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，而一个新的、强而宽的、长 波长的无振动精细结构发射峰出现。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激 发单线态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。
4
荧光探针与分子结构的关系
• 荧光探针的性能与探针的共轭体系大小、共轭π键体系的共平面性和 刚性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何构型等因素 相关。
➢ 给电子取代基如：-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR和-CN。 ➢ 吸电子取代基如：-C = O，-COOH，-CHO，-NO2和-N=N-。 ➢ 荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的
选择性荧光探针
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ü荧光探针的概述 ü荧光探针的设计原理 ü荧光探针的识别原理 ü荧光分子探针的特点 ü文献讲解
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荧光探针概述
•荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上， 选择性的将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量 的荧光信号的分子测量装置。 •荧光分子经过特殊的设计，能够选择性识别待测物，再将这 种识别信息转换成荧光信号传递给外界，具有这种功能的分 子就是荧光探针分子。
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基于光诱导电子转移机理设计的荧光分子探针
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2、分子内电荷转移
分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团 上同时连有推电子基团（电子给体）和吸电 子基团（电子受体）,通过π键提供电子转移的 通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸 电子基团或推电子基团本身充当识别基团的 一部分。当识别基团和被分析物结合后，作 为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推 拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结 构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱 发生变化，主要是光谱红移或蓝移 。
3
荧光探针分子的结构
荧光探针分子通常由三部分组成：
• 识别基团（receptor） • 荧光基团（fluorophore） • 连接体部分（spacer）
Fluorephore Spacer hv
F
S
Receptor R
Analyte
strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由于 识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力， 因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的 变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。
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Cu2+
CN-
Cu(CN)2
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4
化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探针本身荧光 很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬灭了氟硼荧的荧光，加 入氰根离子后，由于铜离子与氰根离子的结合常数更大，从而把作为荧 光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶 液，荧光恢复，而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根 离子的检测。
7
1
2
作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫 醚以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醚上的硫原子、席 夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2，抑 制了席夫碱上C=N键的旋转，实现了荧光从无到有的变化。
8
2、置换法
识别基团
被分析物
结合荧光基团
识别基团 结合被分析物
荧光基团
该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来 实现对被分析物的检测。
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1、光诱导电子转移机理（PET）
光诱导电子转移体系是由包含电子给体的识别基团部分R，通过间隔基 S(如-CH2-)和荧光团F相连而构成的。 基于PET机理设计的荧光分子探针，在未结合客体之前，探针分子不发 射荧光或荧光很弱，而一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作 用就会受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。
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3、化学计量计法
探针分子 被分析物
新物质A
探针分子 被分析物
中间体
新物质B 新物质C
（I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物； （II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质。
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荧光分子探针识别原理
荧光分子探针主要有如下几种识别机理： Ø光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer） Ø分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer） Ø荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer） Ø形成激基缔合物（excimer/exciplex）
取代，一般指的是卤素(Cl，Br和I)的取代。芳烃取代重原子后，荧光 强度一般随卤素原子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。
5
荧光分子探针的设计原理
Ø 键合-信号输出法 Ø 置换法 Ø 化学计量计法
6
1.键合-信号输出法
荧光 连接体 识别 被分析物
基团
基团
信号输出
Ø 键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基 团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。
15Biblioteka Baidu
3 4
基于分子内电荷转移机理设计的荧光分子探针
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3、荧光共振能量转移
荧光共振能量转移 是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光 团(供体Doner)的发射光谱和另一个荧光团(受体Acceptor)的吸收 光谱有一定程度的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时(一般 小于1000nm)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象 ，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。
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基于激基缔合物设计的荧光分子探针
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荧光分子探针的特点
Ø荧光探针的荧光必须与生物样品的背景荧光易于区别; Ø荧光探针必须不干扰研究的主体; Ø荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面 都有严格的要求。 目前使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类，香豆 素类等化合物。
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罗丹明类
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4、激基缔合物/复合物
如果两个相同的荧光团之间的位置和距离合适，其中一个荧光团被激发以后 就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物(excimer)，其荧光发射光谱 的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，而一个新的、强而宽的、长 波长的无振动精细结构发射峰出现。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激 发单线态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。
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荧光探针与分子结构的关系
• 荧光探针的性能与探针的共轭体系大小、共轭π键体系的共平面性和 刚性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何构型等因素 相关。
➢ 给电子取代基如：-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR和-CN。 ➢ 吸电子取代基如：-C = O，-COOH，-CHO，-NO2和-N=N-。 ➢ 荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的
选择性荧光探针
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ü荧光探针的概述 ü荧光探针的设计原理 ü荧光探针的识别原理 ü荧光分子探针的特点 ü文献讲解
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荧光探针概述
•荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上， 选择性的将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量 的荧光信号的分子测量装置。 •荧光分子经过特殊的设计，能够选择性识别待测物，再将这 种识别信息转换成荧光信号传递给外界，具有这种功能的分 子就是荧光探针分子。
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基于光诱导电子转移机理设计的荧光分子探针
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2、分子内电荷转移
分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团 上同时连有推电子基团（电子给体）和吸电 子基团（电子受体）,通过π键提供电子转移的 通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸 电子基团或推电子基团本身充当识别基团的 一部分。当识别基团和被分析物结合后，作 为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推 拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结 构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱 发生变化，主要是光谱红移或蓝移 。
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荧光探针分子的结构
荧光探针分子通常由三部分组成：
• 识别基团（receptor） • 荧光基团（fluorophore） • 连接体部分（spacer）
Fluorephore Spacer hv
F
S
Receptor R
Analyte
strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由于 识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力， 因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的 变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。
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Cu2+
CN-
Cu(CN)2
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化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探针本身荧光 很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬灭了氟硼荧的荧光，加 入氰根离子后，由于铜离子与氰根离子的结合常数更大，从而把作为荧 光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶 液，荧光恢复，而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根 离子的检测。
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作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫 醚以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醚上的硫原子、席 夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2，抑 制了席夫碱上C=N键的旋转，实现了荧光从无到有的变化。
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2、置换法
识别基团
被分析物
结合荧光基团
识别基团 结合被分析物
荧光基团
该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来 实现对被分析物的检测。
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1、光诱导电子转移机理（PET）
光诱导电子转移体系是由包含电子给体的识别基团部分R，通过间隔基 S(如-CH2-)和荧光团F相连而构成的。 基于PET机理设计的荧光分子探针，在未结合客体之前，探针分子不发 射荧光或荧光很弱，而一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作 用就会受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。
10
3、化学计量计法
探针分子 被分析物
新物质A
探针分子 被分析物
中间体
新物质B 新物质C
（I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物； （II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质。
11
荧光分子探针识别原理
荧光分子探针主要有如下几种识别机理： Ø光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer） Ø分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer） Ø荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer） Ø形成激基缔合物（excimer/exciplex）
取代，一般指的是卤素(Cl，Br和I)的取代。芳烃取代重原子后，荧光 强度一般随卤素原子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。
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荧光分子探针的设计原理
Ø 键合-信号输出法 Ø 置换法 Ø 化学计量计法
6
1.键合-信号输出法
荧光 连接体 识别 被分析物
基团
基团
信号输出
Ø 键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基 团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。
15Biblioteka Baidu
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基于分子内电荷转移机理设计的荧光分子探针
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3、荧光共振能量转移
荧光共振能量转移 是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光 团(供体Doner)的发射光谱和另一个荧光团(受体Acceptor)的吸收 光谱有一定程度的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时(一般 小于1000nm)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象 ，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。