降解苯酚微生物的选育

降解苯酚微生物的选育

一、实验目的

1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。

2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。

二、实验原理

酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。

含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。

三、实验材料

1.菌源含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。

2.培养基耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯酚培养液b。

3.试剂2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液。

4.其他稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。

四、实验方法

1.采样

自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。

2.分离纯化

一般微生物在含酚培养基上不能生长。苯酚耐受菌株的筛选，可采用药物抗性菌株一样的梯度平板法。即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性细胞在平板上的一定剂量药品的部位长成菌落，从而判定该菌耐受酚的能力。

1、梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7～l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7～l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。由于苯酚的扩散作用，造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度。

2、涂布法分离：将采集的样品作10倍梯度稀释，按涂布法分离，30℃培养2

天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30℃培养2天。

3、耐酚菌驯化

先将从含酚废水采集的活性污泥放入苯酚无机培养液中（苯酚终浓度25mg/L，MgSO4.7H2O终浓度0.3%, KH2PO4终浓度0.3%），30℃振荡培养6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L）30℃振荡培养4～6天；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至200mg/L）30℃振荡培养4～6天，再提高到流加250mg/L苯酚无机培养液，30℃培养4天，从中选出对酚耐受力强的菌株。

4、性能测定。

初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。

复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中，30℃振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚降解率达>80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。

五、实验报告

1．记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。

2．根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。

3．记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。

耐酚细菌培养基：

斜面固体培养基：肉膏蛋白胨固体培养基，每支斜面中加0.4mL苯酚溶液（6g/L）。液体培养基：在一个500mL锥形瓶中装166.6mL的肉膏蛋白胨培养液，灭菌后加入5 mL苯酚溶液（6g/L）。

耐酚真菌培养基：

葡萄糖2g，酵母膏0.5g，马铃薯汁20mL，微量元素溶液10mL，苯酚25-75mg，蒸馏水70mL，pH5-6，0.1Mpa 灭菌20min。

苯酚无机培养液：

苯酚：25mg(或100或250mg), MgSO4.7H2O 0.3g，KH2PO4 0.3g，蒸馏水100mL，pH7.0-7.2，0.1Mpa 灭菌20min。