鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息

学与免疫原性分析

王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬

【摘要】为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾(鲴)(Ictalurus punctatus)的Y.ruckeri外膜蛋白ompF基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了ompF蛋白的表达和免疫原性检测.结果显示,ompF基因全长1 095 bp(GenBank登录号KP159420),包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白ompF(GenBank登录号ADK27779.1)亲缘关系最近,序列一致性为99.2％,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域.SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示ompF 蛋白具有较好的免疫原性.以上结果表明ompF基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因.

【期刊名称】《南方水产科学》

【年(卷),期】2016(012)003

【总页数】11页(P24-34)

【关键词】鲁氏耶尔森氏菌;外膜蛋白;ompF基因;分子克隆;生物信息学;免疫原性【作者】王二龙;秦振阳;汪开毓;陈德芳;王均;贺扬

【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动

物医学院,四川成都611130

【正文语种】中文

【中图分类】S941.42

鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)，隶属肠杆菌科、耶尔森氏菌属，呈革兰氏阴性短杆状，是冷水性鲑科鱼类红嘴病(Enteric redmouth disease，ERM)的主要病原菌[1]。早在1952年美国首次发生虹鳟(Salmogarirdneri)红嘴病，1966年RUCKER等[2]从患病虹鳟体内首次分离得到该病原菌。自1952年发现以来，该

菌的地理分布和宿主范围已有明显扩大，现流行于澳大利亚、南非和西欧等地，中国近年来也有该菌感染养殖鱼类发病的报道[3-5]。鲁氏耶尔森氏菌除几乎对所有

的鲑鳟鱼类养殖品种都具感染性外，亦可感染其他鱼类如鲤科(鲢、鳙、鲤、金鱼)、鳗、罗非鱼和鲟鱼等[4,6]，具有广泛的致病性。2008年3月～4月，四川简阳三岔湖网箱养殖的斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)爆发急性传染性疾病，死亡率高达85%，发病鱼表现为口腔周围、下颌、腹壁大量针尖状出血，剖检后发现内脏器

官不同程度出血，经检测诊断为鲁氏耶尔森氏菌感染[7-8]。鲁氏耶尔森氏菌病已

对水产养殖业造成严重的经济损失，相应的防治措施亟需建立。

研究发现，镶嵌在细菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是一种重要的保护性抗原，能有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫，具有良好的免疫保护作用，是候选亚单位疫苗最具潜力的免疫抗原成分之一[9-12]。外膜蛋白

ompF(outer membrane protein F)作为肠杆菌科的主要膜孔蛋白(Porin)之一，

是细菌外膜上的一种非特异性、跨越细胞膜的水溶性的蛋白通道[13]。研究报道，ompF作为目的抗原对抵抗铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和致病性大肠杆菌(E.coli)感染具有良好的免疫保护效果[14-15]。鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF具有典型的革兰氏阴性菌外膜中β-结构孔蛋白的空间结构，且ompF在耶尔森氏菌属中具有较高的保守性，与生物和非生物因素相互作用参与细菌在体内的致病过程[16-17]。此外，因其位于细胞膜外表面，表面暴露的抗原决定簇和抗原

表位可被宿主识别并结合引发免疫反应。目前关于斑点叉尾的鲁氏耶尔森氏菌基因工程疫苗研究几乎空白，仅有早期Y.ruckeri灭活疫苗的研究[18-19]，对其外膜

蛋白作为亚单位疫苗的研究尚未见报道。因此筛选外膜蛋白ompF作为亚单位疫

苗的候选目的抗原，对控制和预防鲁氏耶尔森氏菌感染具有很大的研究和应用价值。文章在前期斑点叉尾源鲁氏耶尔森氏菌分离、鉴定的基础上，设计特异性引物PCR扩增Y.ruckeri外膜蛋白ompF基因，通过分子克隆、双酶切和测序鉴定验

证扩增得到的基因为ompF基因，应用生物信息学分析工具对ompF基因的核苷

酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和ompF蛋白的抗原表位预测，并进行了ompF蛋白的原核表达和免疫原性分析，为筛选ompF作为斑点叉

尾抵抗鲁氏耶尔森氏菌感染的候选亚单位疫苗目的抗原基因提供了理论依据，同时为进一步研究ompF基因的生物学功能，了解ompF基因结构与功能的关系提供

一定的理论参考。

1.1 菌株

斑点叉尾源鲁氏耶尔森氏菌由四川农业大学鱼病研究中心从患病斑点叉尾分离、鉴定并保存，命名为Yr-WEL01。大肠杆菌DH5α/BL21(DE3)感受态购自天根生化

科技(北京)有限公司。含表达载体pET32a的工程菌由四川农业大学鱼病研究中心保存。

1.2 主要试剂

PCR PreMix、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。pMD19-T(Simple)克隆载体、T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒小量抽提试剂盒、Ni-NTA树脂亲和

层析柱购于上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶NcoⅠ和SacⅠ购自Thermo Scientific公司。兔抗鲁氏耶尔森氏菌血清由四川农业大学鱼病研究中心

制备并纯化。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank中鲁氏耶尔森氏菌Nr34/85菌株的ompF基因全序列(登录号

HM142671.1)，运用Primer 5.0和Oligo 6.0软件在其完整的开放阅读框(ORF)

上设计上下游引物以扩增ompF基因的全序列，并添加酶切位点。引物序列分别

为上游引物(F)5′-CCATGGATGAAGCGCAATATTCTTGCAGTAGTA-3′，下游引物(R)5′-GAGCTCTTAGAACTGATAAACCAAGCCAACA-3′，下划线分别为添加的酶切位点NcoⅠ和SacⅠ,预期扩增片段大小为1 098 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 菌株培养、DNA提取与PCR扩增

挑取低温保存的鲁氏耶尔森氏菌Yr-WEL01菌株接种于BHI脑心浸液营养肉汤中，于28 ℃、120 r·min-1的恒温水浴摇床培养过夜，取2 mL菌液于8 000×g离心2 min收集菌体，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取菌体基因组DNA，以提取的DNA为模板，设置如下参数进行ompF基因的PCR扩增：PCR 反应体系为25 μL，其中PCR PreMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引

物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，无菌超纯水8.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；

94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

取5 μL反应产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，经凝胶成像系统检测并照相。

1.5 ompF基因的T克隆、鉴定与测序