embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究

embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究刘厚明;单万水;曾敏;李全;赵艳敏;邹婧;林牧;赵丹;肖颜玉;邓群益

【摘要】目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)embB306位点及其他突变位点与乙胺丁醇(ethambutol,EMB)的耐药表型及耐多药(multidrug resistant,MDR)的关系;分析embB基因突变与EMB药敏表型及MDR的关系. 方法对临床分离的MTB采用BD MGIT 960 SIRE试剂比例法进行药敏试验,取48株EMB耐药、46株EMB敏感但耐其他药及7株四药均敏感MTB提取核酸并扩增embB基因全序列,对扩增产物进行测序分析embB基因序列,与H37Rv标准株序列比对,分析embB基因各突变位点、形式及频率. 结果 101株MTB发现embB基因序列上有17个不同位点突变形式.53株MTB在embB 基因序列上发生突变,其中46株为EMB耐药,7株为EMB敏感;embB基因野生型的MTB有48株,其中2株为EMB耐药,46株为EMB敏感;embB突变型与embB 野生型的MTB之间EMB耐药率有显著性差异(x2=68.95,P＜0.01).101株MTB 中MDR有51株,其中有42株发生embB突变,9株为embB基因野生型,embB 基因突变率在MDR和非MDR之间有显著性差异(x2=36.9,P＜0.01). 结论embB306位点与EMB耐药及MDR中度相关,embB基因突变与EMB耐药及耐多药结核菌(multidrug resistant-Mycobacteriumtuberculosis,MDR-TB)高度相关,embB基因突变可作为MDR-TB的检测分子标记物,指导临床用药.

【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》

【年(卷),期】2017(009)001

【总页数】8页(P16-22,32)

【关键词】结核分枝杆菌;embB基因;突变;乙胺丁醇;耐多药

【作者】刘厚明;单万水;曾敏;李全;赵艳敏;邹婧;林牧;赵丹;肖颜玉;邓群益

【作者单位】深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市第三人民医院

检验科,广东,深圳518112;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市罗湖区慢性病防治院检验科,广东,深圳518029;深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市第三人民医院肺病科,广东,深圳518112

【正文语种】中文

据世界卫生组织2013年调查数据显示，中国的结核病患者约为85.5万人，其中

耐多药（multi⁃drug resistant，MDR）结核病患者约为5.4万人，我国的结核病和MDR结核病患病严重程度仅次于印度［1］，为世界第二大结核病和MDR结

核病负担大国，控制耐药和MDR结核病的流行已经成为中国结防工作的迫切任务。乙胺丁醇（ethambutol，EMB）是治疗结核病的一线用药之一，EMB作用于靶

分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，从而影响MTB

的细胞壁分枝菌酸⁃阿拉伯半乳聚糖⁃肽聚糖复合物的形成，发挥抑菌作用，使靶分子在细胞内的药物更容易进入细胞，使联合用药发挥协同作用［2］。

目前大部分研究认为MTB耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子表达增高或突变有关，其中embB基因突变改变了阿拉伯糖基转移酶结构，从

而引起耐药［3］。Morkrouslv等［4］对embB306与临床结核病的EMB耐药关系之间研究显示embB序列中306位点突变最常见（约48.3％的EMB耐药和32.5％的EMB敏感但耐其他一线药的MTB发生306位点突变），但是306位点

以外的embB基因突变也可引起EMB耐药，如在耐EMB分离株中，还可以检测到如下基因位点突变：285Phe→Leu、330Phe→Val、630Thr→Ile等［4⁃6］，说明除306位点外还存在其他耐EMB MTB的基因突变位点。本研究对深圳市结核病患者分离的MTB embB基因全序列（3 297 bp）进行测序分析，期许发现更多与耐EMB相关的embB突变位点，提高MTB的EMB药敏鉴定的准确性，可有效控制耐EMB结核病和MDR的流行。

1.1 研究对象

对2013年1月至2014年5月来院就诊结核病患者9 038份标本进行MTB的分离、培养和鉴定，共分离出MTB 2 243株，对其中865株进行BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验，选取所有EMB耐药48株，占5.55％（48/865），取EMB 敏感但耐其他药46株，4种药物全敏感7株，共计101株进行研究。

1.2 药物敏感性测定

使用在国际上作为MTB药物敏感性检测的“金标准”——比例法，严格按照BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验操作说明书进行，利福平（ri⁃fampin，RFP）、异烟肼（isonicazide，INH）、EMB和链霉素（streptomycin，SM）药敏判读折点浓度分别为1 mg/L、0.1 mg/L、5 mg/L和1 mg/L，结果判读为耐药（R）或敏感（S）。本文MDR是指至少同时耐利福平和异烟肼，多耐药是指不同时耐利福平和异烟肼，但至少耐2种药。

1.3 核酸提取

取MTB培养阳性菌悬液1 mL，80℃灭活60 min，13 300 rpm离心10 min，弃上清；沉淀用1 mL生理盐水悬浮，13 300 rpm离心10 min，弃上清；重复上述步骤一次。沉淀加入50 μL去离子水，涡旋震荡混匀，干浴锅100℃×10 min，13 300 rpm离心10 min，离心后的上清即可作为PCR扩增模板。

1.4 目的基因扩增、测序及测序数据分析