反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应

反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药

性的逆转效应

摘要：目的探讨多药耐药性逆转的新方法。方法应用基因重组方法构建能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入膀胱癌耐药细胞系中，测定转染细胞对不同药物的耐药性，观察反义核酸对MDR的逆转效应。结果耐药细胞经导入反义核酸逆转录病毒质粒后，对阿霉素(ADM)、秋显著降低（P＜0.01）；细胞膜上P-糖蛋白(P-GP)染色信号水仙素(COL)的IC

50

显著减弱。结论反义核酸是逆转膀胱癌多药耐药性的有效方法。

关键词：膀胱肿瘤癌多药耐药性

Reversal of multidrug resistance of bladder cancer cell line with

antisenes RNA

HE Bin

（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military

Medical University, Chongqing 400037,China）

（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）

YANG Tangjun

（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military

Medical University, Chongqing 400037,China）

JIN Xiyu,et al.

（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military

Medical University, Chongqing 400037,China）

Abstract：Objective To explore the new reversal method of multidrug resistance of bladder cancer cell line.Methods A retroviral plasmid pLXSN-AS(+) containing the mdr1 mRNA antisense gene was cloned by inserting 1383bp fragment of mdr1 cDNA into multiple cloning sites of retroviral vector pLXSN. For evaluating the reversal efficiency of antisense RNA the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) was transfected into multidrug resistant cell lines BHA-60 with liposome.Results

After the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) being transduced, the BHA-60 cell line showed significant decrease of IC50 to drug (P＜0.01)and the P-GP positive signal. Conclusions Antisense is a valuable method to reverse multidrug resistance of bladder cancer cell line.

Key words：Bladder neoplasms Carcinoma Multidrug resistance▲

为探讨膀胱癌多药耐药性（MDR）逆转的方法，我们构建了能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入耐药的膀胱癌细胞系BHA-60中，观察反义核酸对MDR的逆转效应。报告如下。

材料与方法

一、材料

1、BIU-87 细胞：人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所。BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系［1］。

2、pLXSN：逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含启动子5’- LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因，由美国Miller教授惠赠。质粒pHDR5A由美国Gottesman教授［2］惠赠。

3、主要试剂：（1）脂质体（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取试剂盒、DNA快速连接试剂盒，购自德国Boehringer Mannheim公司。（2）G418为美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/μl，0.2μm过滤器过滤除菌，分装后保存于-20℃备用。

二、方法

1、细胞培养：细胞置于37℃，含5%CO

的孵箱中培养，培养液为含有10%

2

新生小牛血清的RPMI-1640。

2、反义核酸质粒的构建：用EcoR I酶切质粒pHDR5A，获得1 383bp长的mdr1 cDNA；逆转录病毒载体pLXSN经EcoR I酶切后经CIAP脱磷酸化，制备线性化载体，将mdr1 cDNA与线性化pLXSN载体连接，经氨苄青霉素抗性筛选，再用Hind Ⅲ酶切鉴定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆转录病毒质粒pLXSN-AS （+），该质粒能在细胞内表达长1 383nt的mdr1 mRNA的反义RNA。

3、逆转录病毒质粒pLXSN-AS（+）对细胞BHA-60的转染：按说明书进行操作。选择性培养基为含G418（终浓度为800μg/ml）的1640培养基，定期更换新鲜培养液，共选择培养14～16天，长出肉眼可见克隆，该细胞系命名为BHA-AS。同时用pLXSN作为空载体转染对照。

）的测定采用MTT法

4、细胞耐药性及细胞对ADM、COL半数抑制量（IC

50

［3］。

5、细胞膜上P-糖蛋白（P-GP）免疫组化染色采用ABC法［4］。

结果

一、反义核酸逆转录病毒质粒pLXSN-AS(+)的构建

1 383bp的mdr1 cDNA片段，与pLXSN脱磷酸化载体加入T4 DNA连接酶，连接液常规方法导入大肠杆菌JM109中，挑选经Amp筛选的3个转化子，小量扩增，提取质粒。用HindⅢ酶切鉴定插入方向，结果见1所示。转化子3为正向插入，在5'-LTR启动子作用下能转录出mdr1 mRNA反义RNA。