乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价

乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价

任娇艳;赖婷;江燕清;卢韵君;刘鹏;廖文镇

【摘要】以抗氧化活性及蛋白质回收率为筛选指标对乳清蛋白肽酶解工艺进行优化，用层析柱对酶解液进行逐级分离纯化，并对其分子质量进行检测．研究结果表明：利用胰酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解制备乳清蛋白肽，最佳用酶为碱性蛋白酶、最适底物含量为4.0％、最适加酶量为8000 U／g、最佳酶解时间为4 h；酶解液经DEAE-52纤维素层析后得到的A组分抗氧化活性最好，其还原力为0.3200±0.0041，DPPH自由基清除率为6.58％±0.36％；A组分再

经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离纯化后得到组分G，其DPPH自由基

清除率为6.73％±0.083％；组分G的主要成分为分子质量378 u的肽段，其一级氨基酸组成为赖氨酸（ Lys）、亮氨酸（ Leu）及丝氨酸（ Ser）．%Whey protein peptides were prepared via enzymolysis , and the corresponding conditions were optimized by taking antioxidant activity and protein recovery as two indicators .Then, the enzymatic hydrolysate was separated and purified by means of column chromatography , and the molecular mass of the product was measured .The results indicate that (1) alkaline protease is more suitable for the enzymolysis than trypsogen , flavorzyme and papain, with an optimal substrate dosage of 4.0%, an optimal enzyme dosage of 8000U/g and an optimal enzymolysis time of 4h;(2) fraction A obtained by DEAE-52 cellulose column chromatography exhibits the highest antioxidant activi-ty, with a reducing power value of 0.3200

±0.0041 and a DPPH radical scavenging activity of 6.58%±0.36%;(3) further separation of fraction A via Sephadex G-15 gel column chromatography

helps to obtain fraction G with a DPPH radical scavenging activity of

6.73%±0.083%; and (4) the main component identified from fraction G , which contains three amino acids (namely Lys, Leu and Ser), is of a molecular mass of 378u.

【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2015(000)002

【总页数】7页(P1-7)

【关键词】乳清蛋白;酶解;分离;纯化;活性评价;DEAE-52离子交换柱层

析;Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析

【作者】任娇艳;赖婷;江燕清;卢韵君;刘鹏;廖文镇

【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640【正文语种】中文

【中图分类】TS252.9

乳清蛋白是将牛乳的pH值降低至4.6，沉淀去除酪蛋白后保留在上清液中的多种蛋白质组分的总称，占牛乳总蛋白的20%(质量分数)左右，包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛乳血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白及乳过氧化物酶等[1-2] ，且富含必需氨基酸，是一类营养价值较高的优质蛋白.乳清蛋白具有蛋白含量高，脂肪、胆固醇和乳糖含量低的特点，且易消化吸收，具有较高的营养价值[3-4].

生物活性肽源于蛋白质，是对生物体的生命活动有重要调节作用的肽类化合物，具有吸收快、效率高等特点.酶解法是目前制备生物活性肽最常见、有效的方法，该

方法具有生产条件温和、水解条件易控制且水解产物安全性较高等特点.随着目前

乳源活性肽的研究与相关产品的开发，大量研究证明乳清蛋白中含具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗菌、抗氧化及抗病毒等生物活性的肽段[5-

9].Castro等[10]研究了不同浓度的乳清分离蛋白对B16F10黑色素瘤细胞增殖的

影响，发现较低浓度的乳清分离蛋白有利于抑制癌细胞增殖;Pea-Ramos等[11]将乳清分离蛋白的水解物加到熟猪肉饼中，由Protamex酶解的乳清蛋白的抗氧化

性显著提高，抑制了共轭二烯和TBARS等脂类氧化中间产物的形成；Ferreira等[12]用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备了ACE抑制肽，并利用PR-HPLC分离得到了

肽段ALPMHIR，具有较好的降血压活性.目前关于乳清蛋白的研究多集中在乳清

蛋白成分分析[13]、乳清多肽的制备[14-15]、酶解工艺及抗氧化活性 [15-16]等

方面，对其分离纯化及分子质量测定的研究相对较少.

本研究以WPC80浓缩乳清蛋白粉为原料，酶解制备乳清蛋白肽，并利用控制变量法对乳清蛋白酶解工艺进行优化，以提高乳清蛋白的蛋白质回收率及利用率；之后，将乳清蛋白酶解物过DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephadex G-15葡聚糖凝胶

层析柱，对乳清蛋白酶解物进行逐级分离纯化，并对分离纯化后组分进行分子质量分析，初步确定乳清蛋白肽一级氨基酸序列组成.

1.1 材料与试剂

WPC80浓缩乳清蛋白粉，产地为美国哥伦比亚，购自广州市比灵天然配料有限公司；复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶和碱性蛋白酶，购自南宁庞博生物工程有限公司；DEAE-52纤维素层析柱填料、Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱填料，购自广州市齐云生物技术有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，购自上海迈

瑞尔化学技术有限公司；乙腈，购自瑞典Pharmacia公司；标准混合多肽，购自