丹参多糖体外抗氧化抗肿瘤研究

丹参多糖体外抗氧化与抗肿瘤研究焦亚东1杨兴斌2*（1.陕西师范大学教育部药用资源与天然药物化学重点实验室，陕西西安710062；2. 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）摘要：采用水提醇沉法制备丹参多糖（SMP）。

通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化HPLC-UV法表征SMP的单糖组成。

通过DPPH·自由基、超氧阴离子、羟自由基、还原能力体系评估SMP的抗氧化能力。

采用MTT法、LDH法和流式细胞术（FCM）评价SMP的抗肿瘤活性。

结果表明，SMP主要由半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gla）组成，其摩尔百分含量分别为4.36%、31.11%和65.52%。

SMP 具有一定的抗氧化活性，且呈现量效关系。

同时，SMP对人结肠癌细胞（LoVo）的生长具有显著的抑制作用，并且表现出一定的剂量依赖性，流式细胞术的分析结果表明SMP能显著地诱导LoVo细胞凋亡并能将LoVo细胞抑制在S期。

关键词：丹参多糖；抗氧化；抗肿瘤Antioxidant, Antineoplastic activity of PolysaccharideExtract from Salvia miltiorrhiza Bge.JIAO Ya-dong1, YANG Xing-bin2*(1 Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China;2 College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University,Xi'an 710062, China )Abstract: SMP was extracted by the method of water boiling and ethanol precipitation. The monosaccharide compositions of SMP was characterized by PMP precolumn derivatization procedure with HPLC-UV. In addition, the antioxidant potential of SMP was evaluated using the method of reducing power, and scavenging DPPH•radical, superoxide radical and hydroxyl radical. Moreover, the antineoplastic activity of SMP was evaluated by MTT assay, LDH assay and flow cytometry (FCM). The results showed that SMP was composed of galacturonic acid1作者简介：焦亚东（1985—），男，硕士生，主要从事天然药物化学方面的研究。

* 通讯作者：杨兴斌（1969—），男，副教授，硕士生导师，主要从事食品药品质量标准、食品分子营养学以及生化药理方面的科研工作。

Email:***************.cn(GalUA), glucose (Glc) and galactose (Gal) in the mole percents of 4.36%, 31.11% and 65.52%. The antioxidative experiment of SMP indicated that it exhibited various degrees of antioxidant activities in a dose-dependent manner. In addition, SMP exhibited significant antiproliferative activity against LoVo cell line in a dose- and time-dependent manner. Moreover, FCM analysis demonstrated that SMP significantly induced the apoptosis of LoVo cell and caused cell cycle arrest at S phase.Key words: SMP; Antioxidant activities ; Antineoplastic activity丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科植物丹参的干燥根和根茎[1]，是著名的活血化瘀药，临床广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血管疾病的治疗[2]。

人们在研究中发现从丹参根中提取到的多糖，经口服和肌注，用于氨基核苷诱导的实验性肾病模型和四氯化碳引发的肝损伤模型时能减少尿蛋白的排泄，抑制血清胆固醇和脂质过氧化物浓度的提高，降低肝损伤引起的丙氨酸转氨酶ALT 升高，并改善血清白蛋白与球蛋白的比值(A/G) [3]，丹参多糖能降低 LPS 诱导的急性肝损伤模型小鼠肝组织中 MDA 含量，升高 GSH 含量，降低血清ALT 含量[4]，且具有明显的抗免疫性肝损伤的作用[5]。

然而，对丹参多糖的抗氧化、抗肿瘤的研究报道较少，本实验通过评估丹参多糖体外抗氧化及抗肿瘤活性，为丹参多糖的进一步开发及临床应用提供依据。

1仪器、材料与试剂仪器 AL104电子天平，PL2002电子天平（Mettler Toledo）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅，LGJ-10冷冻干燥机（巩义市予华仪器有限公司）；H2050R-1高速离心机（湖南湘仪集团）；透析袋（截留分子量为8000-10000）（华美生物工程公司）；723型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LC-2010A高效液相色谱仪，Class-VP 6.1色谱工作站（日本Shimadzu公司）；MILLI-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；RT6000酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；FAC SCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；TS 100倒置显微镜（Nikon公司）；IX 71倒置荧光显微镜（OLYMPUS公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏净集团）；Megafuge 1.0R冷冻离心机，二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）。

材料购买于西安市场，经陕西师范大学田先华教授鉴定为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)，洗净后在室温下自然风干。

试剂D-甘露糖（Man），D-核糖（Rib），L-鼠李糖（Rha），D-葡萄糖醛酸（GlcUA），D-半乳糖醛酸（GalUA），D-葡萄糖（Glc），D-木糖（Xyl ），D-半乳糖（Gal），L-阿拉伯糖（Ara），D-岩藻糖（Fuc），抗坏血酸（Vc）均购自Sigma公司（St. Louis, USA），铁氰化钾（[K3Fe(CN)6]）和三氯乙酸（TCA）购自Sigma公司（Sigma-Aldrich GmbH，Sternheim，Germany），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氮蓝四唑（NBT）、还原型辅酶（NADH）和吩嗪甲硫酸盐（PMS）购自Applichem（Darmstadt，Germany），浓硫酸，重蒸苯酚，三氟乙酸（TFA），三乙胺（TEA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）分别购自德国Merck公司和北京化学试剂公司。

色谱甲醇和乙腈均购自美国Honeywell公司。

其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

2 实验方法2.1 MSP的制备取丹参药材，粉碎，过80目筛，加入适量无水乙醇，80 ℃水浴回流脱脂2次，残渣晾干，加入10倍体积的水，80 ℃水浴，搅拌浸提4 h，过滤，残渣加水反复浸提3次，合并滤液。

浓缩至适宜体积，加入无水乙醇至终浓度为80% ，醇沉3次。

收集沉淀，反复冻融10次除蛋白，3000 r/min，10 min，收集上清，透析3 d，冷冻干燥，得SMP粗品[6]。

2.2 总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[7]测定SMP中总糖含量。

2.3 单糖组成表征参照文献[8]的方法，对SMP的单糖组成进行表征。

2.4 体外抗氧化活性测定2.4.1 清除DPPH·自由基作用的测定[9]精确称取 4 mg 的 DPPH·，用甲醇100 mL溶解并。

将 1 mL 不同浓度的待测液与3 mL DPPH·溶液依次加入试管中，摇匀，黑暗处理20 min，于517 nm 处测定吸光度 A i（本底组以甲醇代替DPPH·），蒸馏水代替待测液为阴性对照，以 Vc 作阳性对照。

根据下列公式计算清除率：清除率（%）＝ [1－(Ai－ Ac)/ Aj] ×100%式中Ai为样品管的吸光值；Aj为样品本底的吸光值；Ac为本底的吸光值。

2.4.2 总还原力的测定[10]将 1 ml不同浓度的待测液分别与 2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/LNa2HPO4/NaH2PO4，pH6.6）及2.5 mL 铁氰化钾（1%）混合，混合物在50 ℃水浴中孵育 20 min，然后加入 2.5 mL 的 TCA（10%）终止反应，3000 r/min 离心10 min，取上清液2.0 mL，依次加入2.0 mL 水和0.5 mL FeCl3（0.1%），混匀后于700 nm处测定吸光度。

Vc做阳性对照。

2.4.3 清除超氧阴离子（O2•−）作用的测定[11]试管中依次加入 1 mL NBT（81 μM）溶液，1 mL NADH （468 μM）溶液，1 mL多糖溶液，0.4 mL PMS（88 μM）溶液，混匀后静置5 min，于560 nm处测其吸光值。

用水代替多糖溶液做阴性对照，水代替PMS做本底组对照，Vc做阳性对照。

按以下方程计算清除率：清除率（%）＝ [1－(Ai－Ac)/ Aj] ×100%式中Ai为样品管的吸光值；Aj为样品本底的吸光值；Ac为本底的吸光值。

2.4.4 清除羟自由基（·OH）活性测定用2-脱氧-D-核糖法测定样品对羟自由基的清除活性[12]。