蛋白质相互作用研究方法及其应用

・技术与方法・

生物技术通报

B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N

2006年增刊

蛋白质相互作用研究方法及其应用

王海波　安学丽　张艳贞　王爱丽　李巧云　晏月明

(首都师范大学生命科学学院,北京　100037)

摘　要:　过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。

关键词:　P DT Y2H T AP FPET SPR

Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es

W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing

(College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037)

Ab s tra c t:　W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2

teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced .

Key wo rd s:　P DT Y2H T AP FPET SPR

作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@

随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。

1　噬菌体展示技术(P DT )

大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人

[1]

将R I 核酸内切酶基因片段

连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。

噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人

[2]

利用噬菌体展示技术构建了随机多

生物技术通报B iotechnology　B u lletin2006年增刊

肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方式。由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸,所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依赖的氨基酸残基[3],从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别,酶与底物的结合等等,突破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。

噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致性。到现在已相继成功构建了f1、M13、T4等噬菌体表达载体,为蛋白质组学的发展提供了有利的工具。Jes pers等[4]利用噬菌体展示技术,通过热变性发展了一种选择抗凝集蛋白的方法,这一方法的建立对于抗凝集蛋白的选择、鉴定;防止或促进蛋白的凝集反应以及诊断由凝集蛋白引起的疾病等方面都意义重大。

2　酵母双杂交系统(Y2H)

酵母双杂交系统(Yeast t w o2hybrid syste m, Y2H)是1989年由Fields等[5]提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作用的标准方法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角色[6]。

Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子G AL4的详细了解。G AL4包括两个可以独立的结构域:N末端的DNA结合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的转录激活域(Transcri p ti on activating domain,DNA2AD)。DNA2BD可以与DNA分子的上游激活序列结合, DNA2AD则可以激活下游基因的转录,只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。双杂交技术正是利用了G AL4的这一特点,将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与G AL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA-BD和DNA-AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。

酵母双杂交系统简单快速,最常用于鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白,同时也是发现新的蛋白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究手段。T RPC通道是一组Ca2+流量调节通道蛋白,研究证明磷脂酶Cγ1(phos pholi pase Cγ1,P LC2γ1)结合并控制该通道,对降低Ca2+流量是必要的,但一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。Ros2 sum[7]等人应用Y2H系统,构建了pG BKT72BD2T R2 PC3和pG ADT72AD2P LC2γ1两个载体,共同转化到酵母当中,以Lacz为报告基因,发现P LC2γ1只特异的与TRPC3相结合。实验人员又构建了载有不同氨基酸长度T RPC3与P LC2γ1的双杂交系统,发现TRPC3与P LC2γ1的相互作用只依赖于TRPC3中对应的PH相似结构域中40～46个氨基酸,从而建立了一个广泛的信号转导模型。

3　串联亲和纯化(T AP)

近年来质谱技术发展迅速,其功能强大且灵敏度高,常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基,但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合体,成为质谱在这方面应用的一个限速步骤[8]。1999年R igaut[9]等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法———串联亲和纯化(Tande m affinity puri2 ficati on,T AP),兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。

串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个T AP标签,该标签由I gG 结合结构域(Pr ot A)及一个钙调蛋白结合多肽(CBP)组成,结构域与多肽之间由一个TE V蛋白酶切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有T AP标签的基因,温和裂解细胞,获取细胞抽提物,将抽提物加入I gG亲和柱, T AP标签的Pr ot A端会与I gG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。

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