果蔬中多酚氧化酶对褐变的影响及抑制方法

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3.3 生物技术 通过对果蔬基因改良,选育抗褐变新品种,达 到抑制褐变的目的。目前较成功的是反义 RNA。由于生物技术可以免除繁琐的灭酶 工艺,避免使用抗氧化剂带来的潜在隐患,具 有广阔的前景。
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四、问题与展望
关于果实酶促褐变方面的研究很多，褐变 机理也比较复杂，目前尚未完全弄清。关 键问题集中在对PPO及其底物的研究以及 采后贮藏环境对酶促褐变的影响。有关果 实贮藏前的营养状况(主要决定于果树栽培 的外界气候及土壤条件)与酶促褐变的关系 研究较少。酶促褐变与果实衰老有密切关 系，衰老过程中酶与底物的分区定位遭到 破坏是导致酶促褐变的主要原因。PPO合 成基因的表达可能与衰老有关。对PPO的 深入研究有望从分子水平上搞清酶促褐变 的机理，为控制酶促褐变提供新方法。
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3.1.2 气调 通过改变贮藏环境的气体成分,减轻褐变,保 持果蔬采后品质。由于它具有保鲜期长、 无污染等优点,在国际上倍受关注。Qun Shen等在10℃下采用0.04 mm的聚乙烯袋包 装(2%O2、5%CO2、93%N2)贮藏竹笋,可明 显抑制过氧化物的活性及丙二醛(PDA)的合 成。
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3.2 化学控制 3.2.1 亚硫酸盐 亚硫酸盐是传统的褐变抑制剂。但它破坏 营养,使组织软化并产生异味,且有害健康,美 国FDA已对其使用做出限制。因此寻找安 全的亚硫酸盐替代品已成为趋势,多糖的硫 酸盐已被证明有抗褐变能力。
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3.2.2 4-己基间苯二酚(4-HR) 作为新型抗褐变剂,获得专利的芳香族抗氧 剂,已证实无系统性毒性。大量实验发现可 抑制微生物生长与果蔬褐变,延长贮藏期。 Monsalve等使用0.025%的4-HR浸渍苹果片, 可保持30 d不明显褐变。
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四、问题与展望
改变PPO基因的表达 利用反义RNA技术反向表达PPO基因，修 饰转基因植株中多酚氧化酶基因的表达， 从而控制酶促褐变。 目前已成功利用该技术得到了无褐变的马 铃薯品系。除了对苹果、梨、茶叶、小麦 等作物的报道外，而且对于其它食品中的 多酚氧化酶的研究也日渐丰富起来。
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铜是酶的活性中心，从蛋白质中除去一部 分或全部铜，将引起酶活性下降或完全失 活，若添加铜的话，酶活又能恢复。不同 果蔬中的PPO铜辅基的数量会有所不同， 如蘑菇中PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO 含1个铜原子。
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2. 多酚氧化酶研究概况
多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界 中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、 真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物 残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其 检测方便，是被最早研究的几类酶之一。1883年 Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物 质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇 多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将 这类酶称为polyphenol oxidase。
3.1 物理控制 3.1.1 热处理 1）加热是最有效的杀酶方法。瞬时高温可 在短时间钝化酶的活性,抑制褐变。Mikal E.Saltveit等发现莴笋切分后24 h PAL酶活 提高6倍到12倍,迅速发生褐变,而在切分前4 h或切分后2 h 45℃热处理90 s,则可防止酶 活升高,控制莴笋褐变。
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果蔬中多酚氧化 酶对褐变的影响 及抑制方法
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Contents
1
2 3
多酚氧化酶的简介
果蔬中多酚氧化酶的褐变机理
果蔬加工中酶褐变的控制的方法
4
问题与展望
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一、多酚氧化酶简介
1. 多酚氧化酶定义 英文名称：polyphenol oxidase 定义：编号为EC1.10.3.1，是一类含铜的氧 化还原酶，催化领苯二酚氧化成邻苯二醌， 也能作用于单酚单加氧酶的底物。 多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶， 苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶， 是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。
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现以苹果等果蔬含单宁物质的酶促褐变为 例，概述引起褐变的过程 多酚在有氧条件下由氧化酶被氧化成过氧 化儿茶酚
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ过氧化儿茶酚与水作用，形成过氧化氢
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儿茶酚在过氧化酶的作用下，受过氧化氢 中的氧化，形成相应的邻苯醌
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4.2 微生物中的多酚氧化酶 4.2.1微生物漆酶 漆酶是三大类多酚氧化酶中作用底物最广的一类。 最早是在1883年由Yoshida首先从漆树液中发现的， 后来人们又从大量的真菌体中发现了漆酶。 漆酶来源很多，结构各异，不同来源的漆酶表现 出来的催化特性相差较大。即便是同一来源，如 同一白腐菌菌种，也可分泌出不同性质的漆酶组 分，包括氧化能力、最适pH、底物专一性等，因 此催化氧化作用也各不相同。
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3）比色法：主要是多酚氧化酶催化邻苯二 酚氧化生成有色产物，单位时间内有色产 物在460nm处的光密度与酶活性强弱成正； 4）碘量滴定法 其中比色法操作简便，结果较准确，目前 最常用。
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二、果蔬中多酚氧化酶的褐变机理 褐变机理 果蔬褐变是指水果和蔬菜加工及其制 品在储藏过程中，产生果蔬组织颜色 变得灰暗或变成褐色的现象。褐变不 仅影响果蔬食品原有的色泽，而且影 响其风味和营养价值。
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3.2.3 1-甲基环丙烯(1-MCP) 1-MCP是乙烯受体的竞争性抑制剂,延缓了 组织软化、衰老和褐变,且无毒、用量低。 EduardoV.de B.等研究证明10℃使用 (1μl/L)1-MCP熏蒸6 h可延缓芒果和柿子的 褐变。
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3.2.4 天然抑制剂 天然抑制剂更易被消费者接受,近年来成为 研究的热点。John Sh等研究发现外源花青 素可抑制采后荔枝果皮脂质的过氧化反应, 一定程度维持果皮组织的膜完整性,减轻褐 变。A.G.Ponce等报道丁香精油、茶树油能 抑制莴苣等的POD活性,抑制褐变。
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5.2 多酚氧化酶的纯化方法 PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利 用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小 而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度 大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐 析剂。
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5.3 多酚氧化酶活性的测定方法 1）检压法：就是在一定的温度、PH值和 基质浓度下，多酚氧化酶氧化基质的速率 与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正 比。因此用瓦氏呼吸计测定耗氧率知多酚 氧化酶活性的高低； 2）氧电极法：主要是利用氧电极测定反应 中的耗氧量来表示酶活力，例如可以用来 测小麦的酶活；
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5.1 多酚氧化酶的提取方法 1）丙酮粉法(常规法) 2）匀浆法 3）匀浆浸提法
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丙酮粉法对PPO酶提取活性损失较大，活 性得率较低，但其酶粉活性尚可、体积小 和便于贮存，可直接应用； 缓冲液匀浆液提取活性得率较高，但酶液 本身活性较高，不利于酶的应用，尚需进 行浓缩、提纯才能达到应用的要求； 采用匀浆法和丙酮粉法二者结合的方法， 是一种很好的提酶方法。
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3.2.5 酸处理 抗坏血酸及其衍生物:抗坏血酸还原醌类,阻 止它们转化为有色物质。它不太稳定，其 稳定的衍生物如抗坏血酸脂肪酸酯(如十二 酸酯,葵酸,棕榈酸抗坏血酸酯)及抗坏血酸2-磷酸盐也有很好的抗褐变作用。抗坏血酸 钙已广泛应用于抑制鲜切果蔬褐变,取得很 好效果,但其缺点是价格较贵。
儿茶酚继续在自发反应下形成1，2，4苯三 酚
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1，2，4苯三酚与邻苯醌反应形成羟苯醌
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羟苯醌起聚合作用产生黑色物质而完成褐 变
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三、果蔬加工中酶褐变的控制的方法
3.1、物理控制 3.2、化学控制 3.3、生物技术
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3.2.6 其他 一些络合物也是很好的褐变抑制剂,如乙二 胺四乙酸(EDTA)。Na+在较高浓度下所带电 荷使酶蛋白发生了盐析,从而抑制PPO活性, 控制果蔬褐变。其有效浓度为10 g/kg～16 g/kg。NO短时低剂量地熏蒸果蔬可抑制褐 变。Xiaolin Zheng等报道使用10μg/l的NO 熏蒸苹果1 h,对抑制苹果褐变有较好效果且 无毒害。
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4.2.2 微生物酪氨酸酶 酪氨酸酶，又叫单酚氧化酶，它可以氧化 L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素。在高等动 物和人类中酪氨酸酶的活性高低与黑色素 的形成速率有关，缺乏此酶活性将引起白 化病。
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5. 多酚氧化酶的提取方法及活性测定 多酚氧化酶是一种重要的末端氧化酶，不 管是对其进行性质、同工酶、活性以及影 响因子的研究，还是对生理功能、基因克 隆等方面的研究，都需要把多酚氧化酶从 物体中分离纯化出来。
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绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内。 马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含 有PPO，含量大约与蛋白质部分相同。 茶叶中的PPO分为游离态和束缚态，前者 主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后 者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器 中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部 位结合呈不溶态。
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但热处理有严重不足之处。高温会刺激并 加速果蔬的呼吸作用,破坏营养,缩短货架期。 因此处理时间一般应少于2 min,并迅速冷却 至0℃以下。 2）低温贮藏。低温下有效降低PPO活性,延 缓呼吸高峰的出现,控制果蔬褐变,延长货架 期。ShiPingTian等实验证明3℃储藏荔枝在 降低总酚含量、抑制褐变方面有很好的效 果。
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对于酶促褐变机理的研究，目前国内比较 接受的是酚、酚酶的区域性假说。酚类物 质和酶在细胞内通过一系列膜系统实现区 域化分布而不能直接接触。切分、高温等 胁迫条件引起膜系统的破坏，从而打破了 区域化分布，使酶和底物相互接触而引起 果蔬褐变。
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含有多酚类的果蔬在多酚氧化酶的催化下， 首先氧化成邻醌；然后邻醌或未氧化的邻 二酚在酚羟基酶催化下进行二次羟基化作 用，生成三羟基化合物；邻醌再将三羟基 化合物氧化成羟基醌；羟基醌易聚合而生 成黑色素。
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3.1.3 可食膜 使果蔬内部维持相当于气调的高CO2低O2 状态,抑制褐变。它具有无色、无味和可食 等优点,一般采用蛋白质、油脂和多糖等材 料,如纤维素基质、支链淀粉、乳蛋白。 LitaoPeng等使用藻酸盐∶果糖∶水= 1∶0.4∶71.5涂膜,可显著抑制鲜切苹果片的 褐变,延长货架期2周。
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3. 多酚氧化酶的分类 在广义上，多酚氧化酶可分为三大类： 单酚氧化酶(酪氨酸酶 tyrosinase) 双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse) 漆酶(laccase)
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4. 多酚氧化酶在自然界的分布 4.1 植物中的多酚氧化酶 在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆 类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是 与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活 性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化， 从而表现出活性。
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Thanaraj S.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO 活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现 PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有 利，相反则利于绿茶的生产。 新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在 于叶绿体和线粒体中。从这两部分分别制 备的PPO，其底物专一性稍有差异。