时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。

血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。

目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。

产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。

目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β-）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3抑制素A（inhibin A）等。

产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。

产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。

检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。

由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。

假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。

二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。

1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。

1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。

唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。

目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。

1.以孕妇年龄作为筛查指标最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。

早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。

一般认为35岁以上的孕妇是DS的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。

但深入研究统计发现，若仅以孕妇年龄≥35岁作为筛查指标，DS的检出率约20%，而约80%的胎儿DS是在年龄小于35岁的孕妇人群中。

因此，不少国家的筛查机构指出“DS 产前筛查应面向所有孕妇而不考虑年龄”。

仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。

图1 孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系2. 以孕妇血清标志物为筛查指标1984年英国Merkatz等最先发现怀有DS胎儿的孕妇血清AFP含量降低，这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将AFP作为35岁以下孕妇胎儿DS的筛查指标。

这一发现很快被其它实验室证实，1987年Bargot发现怀有DS胎儿的孕妇血清中的hCG的水平是正常孕妇的2倍，以孕妇年龄再结合血清中hCG检测，DS的筛查率可达到63%。

1988年，Canick等发现怀有DS胎儿的孕妇血清的水平比正常孕妇低25%。

同年，伦敦Bartholomews医院Wald提出AFP、中uE3ß-hCG、uE三联的筛查方法。

1994年美国妇产科学院向全美医学界正式推荐这3一组合，并得到广泛应用，一直至今。

在上世纪90年代，有学者还相继发现PAPP-A、inhibin A、糖原抗原125（CA-125）等与孕妇怀DS胎儿有关。

也将逐步应用到DS的产前筛查中。

甲胎蛋白（AFP）是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956年由Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种甲种球蛋白。

早孕期由卵黄囊产生，晚孕期由胎儿肝脏大量产生。

胎儿血中的AFP经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血。

孕10周即可在母血中测出AFP，孕11～20周AFP浓度呈线性升高，32～34周（有文献为28～32周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为0。

且孕早期以AFP单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中AFP的检测在孕中期14～20周进行。

正常孕妇血中AFP含量变化见图2与表1。

当孕妇胎儿患DS时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，合成AFP能力降低，致使孕中期母血清AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以<0.4MOM或<0.7MOM为标准）。

但当胎儿出现开放性神经管缺损或腹壁缺损时，破坏了阻止AFP外溢的胎儿屏障，使胎儿体内高浓度的AFP释放，渗透入母体循环，引起母体血清中的AFP显著升高。

因此，AFP也可作为神经管畸形的筛查指标。

参考：马云宝，顾军，何雪云.医学特种检测的临床应用，第1版.北京：原子能出版社，1-2.图2 正常妊娠母血中AFP含量变化趋势表1 正常妊娠母血清AFP含量参考值（ug/L）摘自：方群.妇产科检验诊断学，第1版.北京：人民卫生出版社，62.绒毛膜促性腺激素（hCG）是胎盘的合体滋养层分泌的一种糖蛋白，为胎盘中最重要的激素，由α和β亚基组成，两个亚基可彼此结合，也可游离于血液中。

孕妇血清中的hCG主要以完整的形式存在，游离形式的β-hCG（F-β-hCG）占总hCG的1～8%。

妊娠期母血清中β-hCG水平呈双峰曲线，第1峰于妊娠12周前后（一般8～10周或9～12周），15周后出现生理性下降，20～32周维持低而平稳水平，26周达最低。

第2峰于妊娠37周，明显低于第1峰，至妊娠足月时稍有下降。

在妊娠11周内，血清β-hCG的含量与孕龄密切相关，随妊娠进展呈直线上升，孕龄每增加1天，β-hCG平均增加1.53IU/ml（hCG约每1.3天上升2倍，如未达到此水平，此次妊娠可能是输卵管妊娠—宫外孕，应动态观察），分娩后急剧下降，产后4天降至1 IU/ml，产后9天基本消失。

正常妊娠母血清hCG含量见表2与表3。

胎儿患DS时，胎盘重量低于正常水平，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，因此孕妇血清中hCG浓度下降要比怀正常胎儿的孕妇晚3周左右，致使孕中期（约20周左右）母血清中的hCG浓度呈高水平状态，怀DS儿孕妇血清中游离的β-hCG浓度比正常孕妇至少高2倍（一般>2.5MOM），如图3。

表2 正常妊娠母血清hCG含量参考值（U/L）妊娠期（周）受精后距末次月经 U/L2 4 5~1003 5 200~30004 6 10000~800005~12 7~14 90000~50000013~24 15~26 5000~8000026~38 27~40 3000~15000摘自：周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验，第3版.北京：人民卫生出版社，435.表3 正常妊娠母血清β-hCG含量参考值（mIU/ml）摘自：1.韦振元等.血清β-hCG、HPL和β-hCG/HPL比值对妇产科疾病的临床意义.标记免疫分析与临床，1999，6（1）：9-12.2. 王晓雯等.孕中期各周β-hCG正常值测定及其临床意义.中国优生与遗传杂志，2000，8（2）：62.图3 ß-hCG在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布游离雌三醇（uE3）是雌二醇（E2）和雌酮（E1）的代谢产物，在非妊娠女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。

只有约9%的E3在血液循环中游离为uE3。

在妊娠后期E3由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿和胎盘双方面的功能。

母体血清E3约90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前体生成。

E 3生物合成途径的中断将导致母体血清E3低水平。

造成E3途径中断的情况：胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常等，缺乏E 3的孕妇分娩期将推迟。

在胎儿正常发育的情况下，其母体内uE3含量自29～34周逐渐上升，35～36周开始快速上升，在41～42周（37～38周或40～41周）达高峰，正常妊娠孕妇uE3参考值见表4与图4。

uE3被用于胎儿DS筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇uE3是孕中期变化最大的指标，必须核对孕周。

在孕妇怀DS胎儿时，母体血清中uE3表现为降低异常（一般<0.7MOM）。

目前uE3已是多标记联合筛查中用得相当普遍的标记物之一。

3引自：徐增秀,徐燕红,彭晓燕,等.正常孕妇血清游离雌三醇动态监测的临床价值.标记免疫分析与临床,2000,7(2): 74-75.图4 正常妊娠孕妇血清uE3含量变化趋势妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）是一种大分子糖蛋白，PAPP-A由胎盘合体滋养层和蜕膜产生，属于α2巨球蛋白，具有激活补体，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。

早在1974年Lin等首次报道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出PAPP-A起源于绒毛周围纤维蛋白，其水平随孕周增加而增加。

后来诸多学者分别在孕早期应用PAPP-A结合F-β-hCG（或hCG）作为DS 筛查指标，证实PAPP-A是一种最有意义的标志物。

Wald等及Haddow等在综合归纳了9个国家21个产前筛查诊断中心的研究结果的基础上，用孕妇7种血清标志物以不同组合作筛查指标进行比较，结果显示，PAPP-A诊断DS效果较满意，特别是结合F-β-hCG组合时阳性检出率可达60%，其中假阳性率仅为5%。

Zimmermann等检测了1151例21三体和18三体患者的PAPP-A水平，中位数的倍数分别是0.51和0.08 ，结果显示PAPP-A可作为妊娠DS胎儿产前筛查一个独立的标志物。

孕早期就可以在母体血清中检测到PAPP-A（单胎受精后32天，双胎受精后21天即可在孕妇血清中检测到），随着妊娠进展，母体PAPP-A水平升高，到妊娠足月时达到高峰，此时母血PAPP-A浓度是羊水的10倍，产后6周即测不到。

而整个妊娠期间，胎血中测不道PAPP-A，这是因为PAPP-A分子量大，不能透过胎盘进入血循环。

PAPP-A具有以下优点：在孕早期阶段，母血中即可测到。

当其他妊娠蛋白水平开始下降时，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一种在母血中浓度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。

由于DS胎儿的器官包括胎盘均发育不全，胎盘合体滋养层功能下降，合成PAPP-A减少，因此怀有DS胎儿的孕妇，其血清中PAPP-A一般低于0.25MOM～0.51MOM。