微生物实验 实验四中文
医学微生物实验实验四病原性球菌
相关研究和应用前景
研究方向
• 球菌的耐药性研究 • 球菌的毒力机制研究
应用前景
• 新型抗菌药物的开发 • 快速检测方法的改进
实验的意义和价值
促进健康
通过研究病原性球菌，能够更好地了解和应对 与之相关的疾病，促进人们的健康。
拓展科学知识
通过实验，可以进一步了解微生物领域的知识， 为科学研究的发展做出贡献。
3 柯氏试验
通过培养基的反应性来鉴别链球菌。
2 大肠杆菌鉴别试验
利用培养基鉴别肺炎球菌。
病原性球菌的检测方法
1
涂片法
将样品涂在玻璃片上，使用显微镜观察病原性球菌的形态特征。
2
H2 S产生试验
利用培养基观察球菌对H2S的产生情况。
3
SIM管法
通过尿素和铁盐培养基观察球菌的反应。
病原性球菌实验结果分析
形态观察
观察菌落的形态特征，如颜色、 形状和质地。
病原性球菌的特征和疾病
球菌种类 金黄色葡萄球菌 肺炎球菌 链球菌
特征 黄色菌落，产生金黄色素 多形态，革兰阴性 成链状排列
相关疾病 皮肤感染、食物中毒等 肺炎、脑膜炎等 咽炎、扁桃体炎等
病原性球菌的实验判断
1 甘露醇耐性试验
用甘露醇培养基判断金黄色葡萄球菌。
医学微生物实验实验四病 原性球菌
这个介绍病原性球菌的医学微生物实验将带您了解球菌的分类和特征，病原 性球菌对人类健康的影响，以及与常见球菌相关的疾病。
病原性球菌的分离与鉴定
样本采集
收集可能含有病原性球菌的样 本，如血液、尿液或分泌物。
培养与分离
将样本在含有适宜培养基的培 养皿中培养，分离出病原性球 菌。
微生物大小的测定-实验四
实验四 微生物大小的测定一、实验目的1. 熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法, 掌握测定微生物大小的技能。
3. 巩固光学显微镜的使用方法二、实验要求1. 预习有关微生物大小测定等方面的知识；2. 遵守实验室安全制度, 听从指导教师安排； 3．认真听讲, 不懂就问；4. 完成实验报告三、实验仪器和材料目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片四、实验原理及方法1.目测微尺:目镜测微尺是一块圆形玻片, 在玻片中央把5mm 长度刻成50等分, 或把10 mm 长度刻成100等分。
测量时, 将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同, 目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样, 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正, 以求出在一定放大倍数下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2.物测微尺中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般将1mm 等分成100格, 每格长0.01mm （即10µm ）。
它并不直接测细胞的大小, 而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
五、实验步骤及内容1. 目测微尺的标定两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。
用低倍镜找到物测微尺的刻度, 移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合, 顺着刻度找出另一条重合线。
再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。
2. 菌体大小的测量将物测微尺取下, 换上标本片, 选择适当的物镜测量目的物的大小, 分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数, 再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。
六、实验结果1.将目镜测微尺校正结果填入表1物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度2.在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大., 将结果填入表2序号长/um 宽/um 菌体大小（平均值）长/um×宽/um目镜测微尺格数菌体长度目镜测微尺格数菌体宽度1 2 3 4 5七、思考题1.不改变目镜和目镜测微尺, 而改用不同倍数的物镜来测定同一细菌的大小, 目镜测微尺上所量的物镜上物体的实际长度是否相同？为什么？相似。
实验四微生物的纯培养
微生物纯培养的原理
01
无菌操作
在微生物纯培养过程中，无菌操作是关键。通过在无菌条件下进行样品
的采集、分离、纯化、培养等步骤，确保获得的微生物菌落是单一的、
纯净的。
02
选择性培养基
选择性培养基是根据不同微生物的特殊营养需求和生长特点设计的培养
基，通过选择性培养基能够促进所需微生物的生长，抑制其他微生物的
的微生物群体中分离出来。
纯化
通过反复的分离、移植和纯培养过 程，逐步淘汰其他杂菌，最终获得 纯种的微生物。
鉴定
对纯化的微生物进行形态学、生理 生化及遗传学等方面的鉴定，以确 认其种属和特性。
04
实验结果与分析
微生物的培养结果观察与记录
观察与记录
在实验过程中，我们观察并记录 了微生物在不同培养基上的生长 情况，包括菌落形态、颜色、大 小、生长速度等特征。
微生物纯化
通过反复划线分离或稀释分离 的方法，将微生物逐渐纯化， 获得单一的菌落。
样品采集
根据研究目的选择合适的样品， 采集具有代表性的样品。
微生物分离
通过划线分离法、稀释分离法 等方法将微生物从样品中分离 出来。
微生物培养
将纯化的微生物接种到适宜的 培养基中进行培养，观察其生 长情况并进行记录。
03
改进建议2
寻找成本较低的替代品或国产试剂， 降低实验成本。同时，合理规划实验 材料的使用，避免浪费。
实验在未来的应用前景与发展方向
应用前景
随着微生物资源的深入研究和开发，微生物的纯培养 技术在农业、工业和医疗等领域具有广阔的应用前景 。例如，某些特殊微生物可用于生物农药和生物肥料 的开发，提高农作物产量和品质；某些具有特殊功能 的微生物可用于工业发酵生产；某些药用微生物可用 于抗生素和生物药物的生产。
实验四微生物的染色
2）高压蒸汽灭菌：微生物试验所需仪器培养基，皆可 用高压灭菌锅灭菌
2）灭菌操作过程
A 先加水，放物品，盖锅盖，对称的拧紧螺栓，防 漏气。
B 加热，并开排气阀，冒热气3~5min后关。到所需 压力 计时，达灭菌时间后停止加热
❖ 取水样 • 自来水样的采集 • 河湖、井水、海水水样的采集 • 水样的处置
❖ 初步发酵实验
❖复发酵实验
❖准备工作
• 滤膜灭菌 • 滤膜过滤器安装
❖ 过滤水样
❖ 观察结果
• 挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。 • 将镜检验员革兰氏服性、无芽孢杆菌的菌落再接种一支乳 糖 蛋白胨发酵管，经370c培养24h，产酸又产气者即为大肠菌群阳性 • 计算
试管，中指于其间，斜面向上，管口齐平。
D接种环灭菌
E 将棉花拔出，试管口微绕火焰。用接种环迅速移菌种于另一试 管底部，再接种环上有底部向上画曲线。接种环灭菌。
2）液体接种 由斜面基接种到液体培养基。用接种环将菌种全 送入液体培养基，塞棉花，转动使其混匀。
3）液体培养基中的菌种被接入液体培养基
用无菌移液自菌种管吸取菌液接种到另一液体培养基中赛好 棉塞即可
（2）平板划线分离法
a制作: 将熔化冰冷至50oC的营养琼脂培养基 10~15ml
导入无菌培养皿，凝固成平板
b划线：以无菌操作，接种环挑污泥于在平板上划线，盖盖， 倒置于30oC恒温箱培养48h后观察结果
•2其他接种方法的操作
1）斜面接种技术
A 贴标签
B
点燃酒精灯
C将
一支斜面菌种和一支待接种的斜面培养基放左手，拇指压住两
实验四、环境中微生物的检测课件
观察
补做实验一 下周实验课暂停一次
第一部分：环境中微生物的检测
一、背景介绍 什么是微生物 微生物分布
二、实验目的 了解环境中微生物的分布情况
三、实验原理 提供微生物生长所需的营养要素，在实验
室中培养微生物 灭菌的方法和原理 培养基的特性
四、实验方法 1、倒平板
2、环境中微生物的检测
五、实验报告
记录你所培养的微生物的形态
观察时间4月5日（下周四）
12：00——13：00
梅老师班：外间202
尹老师班：里间203
三、个体形态的观察 1、细菌：简单染色法（接种环，取样）
Hale Waihona Puke 、酵母：水封片3、放线菌：插片法
4、霉菌：切片
作业：
1、将观察的细菌、酵母菌、放线菌、霉 菌其菌落特征填入表格
2、划出细菌、放线菌的个体形态简图
3、初步判断你所培养的环境中的微生物 属于哪一大类并说明理由
预习：实验七 生物体内部组织细胞的切片观察（一）
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
天牡
开丹
放花
；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天 是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
实验四四大类微生物菌落及个体形态观察
三、实验器材：
1、活材料：
培养2天的细菌平板; 培养7-15天的5406放线菌平板； 培养7天的根霉（Rhizpus sp.）、青霉 （Penicillum sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）平板；
2、器材：酒精灯、镊子、载玻片、盖玻 片、 解剖针、显微镜等。
四、实验步骤
气味
不牢 有限
往往有臭味
牢固，不易挑取 有限
有泥腥味
不牢 有限
常有酒香味
较牢 多为无限
往往有霉味
（二）个体形态特征的观察——插片法
接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
（二）个体形态特征的观察——插片法
（以放线菌为例）
① 接种：挑取菌种在培养基平板上密集划线接种或 取0.2ml菌液涂布平板； ② 插片：无菌操作用镊子取灭菌盖玻片以约45°角 插入平板琼脂接种线上；
细菌的菌落
真菌的菌落特征可作为分类依据之一：
四大类微生物菌落比较表
培养基
菌落形状 大小
细菌 牛肉膏
小点状，多 为圆形，个别 呈根状，辐射 状 一般较小 多样（乳白、灰 白、灰、红、 荧光等）正反 面颜色相同
放线菌 高氏一号
圆形 辐射状 较小 多样（灰白、白 红、粉红、 蓝、紫、橙 等）正反面 颜色不同
实验四 四大类微生物菌落及个体 形态观察
一、实验目的：
比较四大类微生物菌落特征; 学习自制水浸片观察霉菌的个体形态.
二、实验原理
1、菌落观察
微生物菌落即微生物聚集在一起的群体结构。 在自然界中，我们肉眼所见到的微生物都是以菌 落状态存在，不同种类的微生物有其特定的群体 结构。因此，根据群体结构（菌落特征），我们 可以初步把它们“分门别类”作粗略鉴定。本实 验通过对细菌、放线菌、酵母菌，霉菌等四大类 微生物菌落特征的观察，学习以菌落特征来区分 四大类微生物的基本方法。
微生实验报告 2012.10.31 实验四 酵母菌的形态观察及细胞死活的鉴别,微生物细胞大小的测定
微生实验报告姓名：王晶晖专业年级：2011级生物技术学号：040312011032实验四酵母菌的形态观察及细胞死活的鉴别，微生物细胞大小的测定一、实验目的1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法.3．了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、实验原理美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。
用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长10μm，每格长（0.01mm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。
实验四微生物形态、菌落的观察(精)
实验四：微生物形态、菌落的观察一、实验目的1．学习在油镜下观察微生物的个体形态2．了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步二、实验材料1．菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2．器材：显微镜，载玻片，染色缸等3．染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液三、实验内容和方法1.涂片将培养14 —16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30分钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
四、注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
因此必须严格把握脱色时间。
2．选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
五、作业要求1．不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？。
实验4 微生物的分离与平板菌落计数法
平板菌落计数法的稀释流程示意图
⑥转移菌液 用一支1ml无菌吸管吸取10-6,10-7,10-8的稀 释菌悬液各0.2ml，向已编好号的无菌平皿。 用涂布器涂匀。 ⑦倒置培养 待平板完全凝固后，倒置于37℃恒温箱中培 养。
⑧计菌落数
培养24、48h、72后，取出平板，算出同一稀 释度三个平板上的菌落平均数，在平板菌落计 数中，可用彩色笔或钢笔在皿底点涂菌落进行 计数，以防漏计和重复。实际工作中同一稀释 度重复对照平板不能少于三个，且同一稀释 度的三个重复对照的菌落数不应相差很大， 否则说明试验误差太大。
由10－6、10－7、10－8三个稀释度计算出 的每ml菌液中菌落形成单位数也不应相差 太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的 稀释度是很重要的，培养后所出现的平均 菌落数小于100个左右为好，否则要适当增 加或减少稀释度加以调整。
【结果记录】
下面的表格是对一个培养时间菌液的平板计 数结果的记录表格，其余培养时间菌液的计 数表格请依此自行制作，将菌落计数结果填 入表格：
【实验报告】
1、平板菌落技术的原理。 2、要获得本实验的成功，那几步最为关键， 为什么？ 3、本实验结果记录与分析。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需 要培养一段时间才能取得，而且测定结 果易受多种因素的影响。 但是，由于该计数方法的最大优点是可 以获得活菌的信息，所以被广泛用于生 物制品检验，以及食品、饮料和水等的 含菌指数或污染程度的检测。
【材料和器皿】
①菌种：培养8h的大肠杆菌。 ②培养基 ：LB培养基。 ③器皿：无菌试管，无菌移液管，无菌平 皿等。 ④其他：无菌生理盐水，试管架，记号笔。
【方法和步骤】
①融化培养基 先将LB固体培养基加热融化，置于50度水浴 锅中备用。 ②倒培养液 将固体培养基融化并冷却至45℃左右倒入加 好样品的平皿中，每平皿约倒入10～12ml培 养基，随即快速而轻巧地晃动培养皿，注意 不要使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
实验四 微生物大小的测定和酵母菌死活细胞鉴定
放台尺→调焦→低倍镜下，使目尺与台尺零点对齐， 并在某一刻度上完全重合（准焦）→低倍、高倍、油镜 下分别计算目尺每格所代表的长度。
2. 制作酵母的美蓝水浸片 在载片上加一滴美蓝染液，挑取酵母与之混匀。用
镊子取盖片，注意避免产生气泡
3. 菌体大小测定 校正完毕，移走台尺，换上制好的面包酵母的水浸
片，先低倍后高倍。面包酵母几乎圆形，测其直径占目 尺多少格，将格数乘上目尺每格代表的长度，即为面包 酵母的实际大小
4. 计算菌体大小 将目尺取出放入盒内保存
五 实验结果1 目尺校正结果Fra bibliotek接物镜
放大倍数
低倍镜 高倍镜
目尺格数
台尺格数 目尺每格代表 的长度（μm）
2 面包酵母的大小：￠ ＝ ？μm
六 注意事项：
1.使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微 尺，可先对刻尺外的圆圈线进行准焦后再通过移动标本 推进器进行寻找。
2.细菌的个体微小，在进行细胞大小测定时一般应选用油 镜，以减小误差。
3.进行显微镜计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置， 找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计 数。
4.酵母菌计数加样品前，一定将菌液摇匀。
七、思考题：
1.更换不同放大倍数的目镜和物镜时，为什么必须用 台尺重新校正目尺？
2.目镜和目尺不变，改用不同放大倍数的物镜来测同 一细菌时，其测定结果是否相同？为什么？
• 美蓝作为无毒性染料，其氧化型呈蓝色，还原型呈无色。 活的酵母细胞具有新陈代谢活性，能使美蓝由氧化型（蓝） 变为还原型（无色），染约3 min，死的酵母或衰老的细 胞代谢能力弱，菌体呈蓝色或浅蓝色。据此区分死活酵母。
环境微生物学-实验四(五) 细菌的纯培养、分离
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
十分多样
相同
一般不同
可见球状，卵圆状或假 丝状细胞
有时可见细丝状细胞
较快
慢
多带酒香味
常有泥腥味或抗生素气 味
不透明 较牢因结合
十分多样 一般不同 可见粗丝状细胞 一般较快 往往有霉味
二、细菌菌落形态的多样性（示意图）
延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）
平板中菌落形态
Hale Waihona Puke 三、菌落特征描写方法说明：检测方法建立的基础——可 测、稳定、重现、可行、简便
浊度与微生物生物量测定
原理：
①细胞的存在会 造成光的散射， 降低光线的透过；
②在一定范围内 细胞浓度与吸光 度成正比
二、平板菌落计数的优缺点
▪ 优点：反映的是微生物活菌数量，可获 得活菌的信息，所以被广泛用于生物制 品检验（如活菌制剂），以及食品、饮 料和水（包括水源水）等的含菌指数或 污染程度的检测。
适用具有特殊生理功能的类群——存在但 不能人工培养形成单菌落，可以利用生化手段 检测出；利用统计学原理计算，结果粗放，只 能得到数量级（近似数）。
（3）菌体浊度的测定（只针对单细胞微 生物）；
利用分光光度计在600nm测定吸光度 值。
（4）细胞干重和湿重的测定（有时湿重 以体积计量）；
（5）各种细胞物质含量的测定（蛋白质、 核酸、 ATP、磷、叶绿素等定量测 定）——建立了多种快速检测方法；
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度(倍数)最高的平均菌落数 乘以稀释倍数（见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应按稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以 稀释倍数（见下表，例5）。
6、若所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300之间，则以最近300或30的平均菌落 数乘以稀释倍数（见下表，例6）。
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糖发酵试验(fermentaton test)
示教：单糖发酵管
甲基红试验（methyl red test）
-
+
VP（Voges-Proskauer）试验
-+
+
-
－
+
Urease Test
尿素酶试验
：
H2S Production
硫化氢试验
-+
IMViC试验(Indole Test; Methyl Red (MR) Test; Voges-
H2S:＋
EMB（Eosin Methyl Blue)平板 ——分离肠道病原菌的弱选择培养基
致病菌: 不分解乳糖，透明,无色，小菌落 非致病菌:分解乳糖，紫黑色
Double sugar iron agar slant
乳糖 固体 FeSO4 半固体 葡萄糖
指示剂:酚红
37℃ 18-24hrs
Double sugar iron agar slant
• 抗酸染色试验是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据， 也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。但抗酸染色阳 性也不一定是结核杆菌，应注意鉴别。
结核分枝杆菌
形态：
• 细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛,芽胞。
染色性：
• 不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中 其他物质蓝色。
培养特性：
• 专性需氧，最适37℃ ，营养要求高，生长缓慢， 18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含 蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2~6周可见 菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色， 不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。
Proskauer (VP) Test; Citrate Utilization Test)
大肠埃希菌 ＋ ＋ － －
产气杆菌 － － ＋ ＋
2.结核分枝杆菌的培养及形态观察
• 发病趋势和临床意义:
• 世界人口中大约1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道， 每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。 近年来，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的 应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。
菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗 粒状或菜花状
抗酸染色
结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经加 温或延长染色时间后能抵抗3％盐酸乙醇的 脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他 分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。
示教：结核分枝杆 菌抗酸染色
• 实验步骤： 1．用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样
• H2S
18-24hrs
– 然后观察下层
– ud••erG发lal酵uyce葡orse萄fe糖rm（e产mt酸at产ion气（）acid, gas ） •• M动o力tivation
• gas
Lactose fermemtation
＋
glucose fermemtation
＋
H2S
-
＋
-
-
＋
＋
＋
lactose solid Fe2SO4
glucose
Semi-solid
指示剂:酚红
o如bse何rv观e 察
–– u上pp层er含lay乳er糖部分
• L乳a糖cto发se酵fe：rm致e病mt菌at红ion色：，非致病菌
黄色pathogenic bacilli—red
• H2S nonpathogenic bacilli3--7y℃ellow
医学微生物学实验
实验四 肠道致病菌的微生物学检查 结核分枝杆菌的培养及形态观察
• 实验内容： • 1.肠道致病菌的微生物学检查 • 2.结核分枝杆菌的培养及形态观察
（抗酸染色）
1.肠道致病菌的微生物学检查
实验目的：
肠道细菌营养要求不高，普通培养基均 能生长。所有肠道杆菌形态、菌落特点相似， 无鉴别意义。但生化反应十分活泼，是鉴定 肠道菌的重要依据。
痰标本
涂片
干燥
固定
3%盐酸乙醇
5’
石炭酸复红
水冲
加热
脱色
注意：不要让染料干枯，需补加染 料，保持冒蒸汽。
30” 水冲
观察
美兰
1’ 水 冲 干燥
抗酸染色---结核杆菌
• 实验材料
痰液1管/小组，抗酸染色染液1套/小组，玻 片1个/人
实验报告内容
抗酸染色法
实验原理、实验步骤、实验结果绘图 和结果分析。
• （2）常用培养基介绍 • 主要包括： SS琼脂平板
伊红美蓝培养基（EMB）
双糖铁培养基
SS平板－分离肠道病原菌的强选择培养基
成分和作用：
– 基础培养基：提供氮源和碳源
– 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非 致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作 用弱。
– 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙 黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白 胨产生碱性物质→菌落淡黄色。
结核分枝杆菌的培养方法
• 1．痰标本培养前处理
（1）酸处理法：痰标本加入4％硫酸稀释2～4倍， 置室温下30min，期间振荡2～3次，使痰液化后 即可接种。
（2）碱处理法：痰标本加入2％氢氧化钠溶液稀释 2～4倍，置37℃温箱内30min，期间振荡2～3 次，痰液化后即可接种。
• 2．接种培养法
取上述处理过的痰液0.1ml均匀接种于改良罗氏 培养基斜面，37℃孵育3～4周后观察菌落特点。
小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理 后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成 1.5×2.0cm卵圆形痰膜，干燥，固定。 2．滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火 焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min（切勿 沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋 势，应补加染液。然后自然冷却，用流水漂去多 余染液。 3．滴加3％盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱 出为止，约30s，水洗。 4．滴加碱性亚甲蓝液复染1min，水洗。 5．滤纸吸干后镜检。
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-
＋
• （3）肠道致病菌的分离鉴定 • ①标本收集 • ②分离培养 • ③初步鉴定 • ④生化反应 • ⑤血清学鉴定
标本
选择鉴别培养基 SS
平板
Байду номын сангаас
双糖铁
37℃
24h
生化反应
菌落
已知Ab检测 未知Ag (玻片 凝集试验)
血清学鉴定
粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程
鉴别肠道致病菌的生化反应
• 糖发酵试验 • 甲基红试验 • VP实验 • 枸橼酸盐利用试验 • 硫化物（硫化氢）生成试验 • 吲哚生成试验 • 尿素水解试验