微生物实验 实验四中文

lactose solid Fe2SO4
glucose
Semi-solid
指示剂:酚红
o如bse何rv观e 察
–– u上pp层er含lay乳er糖部分
• L乳a糖cto发se酵fe：rm致e病mt菌at红ion色：，非致病菌
黄色pathogenic bacilli—red
• H2S nonpathogenic bacilli3--7y℃ellow
医学微生物学实验
实验四 肠道致病菌的微生物学检查 结核分枝杆菌的培养及形态观察
• 实验内容： • 1.肠道致病菌的微生物学检查 • 2.结核分枝杆菌的培养及形态观察
（抗酸染色）
1.肠道致病菌的微生物学检查
实验目的：
肠道细菌营养要求不高，普通培养基均 能生长。所有肠道杆菌形态、菌落特点相似， 无鉴别意义。但生化反应十分活泼，是鉴定 肠道菌的重要依据。
Proskauer (VP) Test; Citrate Utilization Test)
大肠埃希菌 ＋ ＋ － －
产气杆菌 － － ＋ ＋
2.结核分枝杆菌的培养及形态观察
• 发病趋势和临床意义:
• 世界人口中大约1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道， 每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。 近年来，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的 应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。
痰标本
涂片
干燥
固定
3%盐酸乙醇
5’
石炭酸复红
水冲
加热
脱色
注意：不要让染料干枯，需补加染 料，保持冒蒸汽。
30” 水冲
观察
美兰
1’ 水 冲 干燥
抗酸染色---结核杆菌
• 实验材料
痰液1管/小组，抗酸染色染液1套/小组，玻 片1个/人
实验报告内容
抗酸染色法
实验原理、实验步骤、实验结果绘图 和结果分析。
-
-
＋
• （3）肠道致病菌的分离鉴定 • ①标本收集 • ②分离培养 • ③初步鉴定 • ④生化反应 • ⑤血清学鉴定
标本
选择鉴别培养基 SS
平板
双糖铁
37℃
24h
生化反应
菌落
已知Ab检测 未知Ag (玻片 凝集试验)
血清学鉴定
粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程
鉴别肠道致病菌的生化反应
• 糖发酵试验 • 甲基红试验 • VP实验 • 枸橼酸盐利用试验 • 硫化物（硫化氢）生成试验 • 吲哚生成试验 • 尿素水解试验
小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理 后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成 1.5×2.0cm卵圆形痰膜，干燥，固定。 2．滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火 焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min（切勿 沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋 势，应补加染液。然后自然冷却，用流水漂去多 余染液。 3．滴加3％盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱 出为止，约30s，水洗。 4．滴加碱性亚甲蓝液复染1min，水洗。 5．滤纸吸干后镜检。
H2S:＋
EMB（Eosin Methyl Blue)平板 ——分离肠道病原菌的弱选择培养基
致病菌: 不分解乳糖，透明,无色，小菌落 非致病菌:分解乳糖，紫黑色
Double sugar iron agar slant
乳糖 固体 FeSO4 半固体 葡萄糖
指示剂:酚红
37℃ 18-24hrs
Double sugar iron agar slant
• 抗酸染色试验是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据， 也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。但抗酸染色阳 性也不一定是结核杆菌，应注意鉴别。
结核分枝杆菌
形态：
• 细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛,芽胞。
染色性：
• 不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中 其他物质蓝色。
培养特性：
• 专性需氧，最适37℃ ，营养要求高，生长缓慢， 18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含 蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2~6周可见 菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色， 不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。
结核分枝杆菌的培养方法
• 1．痰标本培养前处理
（1）酸处理法：痰标本加入4％硫酸稀释2～4倍， 置室温下30min，期间振荡2～3次，使痰液化后 即可接种。
（2）碱处理法：痰标本加入2％氢氧化钠溶液稀释 2～4倍，置37℃温箱内30min，期间振荡2～3 次，痰液化后即可接种。
• 2．接种培养法
取上述处理过的痰液0.1ml均匀接种于改良罗氏 培养基斜面，37℃孵育3～4周后观察菌落特点。
• H2S
18-24hrs
– 然后观察下层
– ud••erG发lal酵uyce葡orse萄fe糖rm（e产mt酸at产ion气（）acid, gas ） •• M动o力tivation
• gas
Lactose fermemtation
＋
glucose fermemtation
＋
H2S
-
＋
-
-
＋
＋
wk.baidu.com
＋
糖发酵试验(fermentaton test)
示教：单糖发酵管
甲基红试验（methyl red test）
-
+
VP（Voges-Proskauer）试验
-+
+
-
－
+
Urease Test
尿素酶试验
：
H2S Production
硫化氢试验
-+
IMViC试验(Indole Test; Methyl Red (MR) Test; Voges-
• （2）常用培养基介绍 • 主要包括： SS琼脂平板
伊红美蓝培养基（EMB）
双糖铁培养基
SS平板－分离肠道病原菌的强选择培养基
成分和作用：
– 基础培养基：提供氮源和碳源
– 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非 致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作 用弱。
– 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙 黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白 胨产生碱性物质→菌落淡黄色。
菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗 粒状或菜花状
抗酸染色
结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经加 温或延长染色时间后能抵抗3％盐酸乙醇的 脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他 分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。
示教：结核分枝杆 菌抗酸染色
• 实验步骤： 1．用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样