玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
[指南]辅助生殖技术
![[指南]辅助生殖技术](https://img.taocdn.com/s3/m/0aaedc2d590216fc700abb68a98271fe910eaf16.png)
辅助生殖技术辅助生育技术(artificial reproductive technology，ART)是指对配子、胚胎或者基因物质等进行操作而获得新生命的技术，它包括各种帮助不孕症患者妊娠的技术，如促排卵[yao]物治疗、人工授精(artificial insemina．tion，AH)和体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization&emb~o transfer，IVFET)及其各项衍生技术。
目前在ART中的研究热点是IVF一ET及其各项衍生技术。
常规IVF一ET技术主要解决女性不孕问题，特别是输卵管性不孕；在该技术上结合显微操作技术、分子生物学、细胞遗传学等发展起来的衍生技术主要包括有胞浆内单精子注射(intracytoplasmie sperm injection，ICSI)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation geneticdiagnosis，PGD)等。
经过近20年的发展，ART已经取得了惊人的进步。
目前，我国大陆临床ART在许多方面基本上与国际水平接轨，不少中心常规IVFET的成功率已稳定在较高的水平[1]。
本文主要阐述近年IVF一ET及其衍生技术中涉及问题的研究进展。
1 常规IVF-ET常规IVF-ET是指从妇女体内取出卵子，体外培养后加入经过处理获能的精子使之受精，受精卵发育成2～8个卵裂球或囊胚后，移植入母体子宫内并使之着床。
它的适应症为女方输卵管性不孕、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫性不孕、男方轻度少精症、弱精症或畸精症、原因不明不孕特别是经过其他助孕方法多次失败。
主要程序包括控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、手术取卵、体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等步骤。
1．1 COH方案的改进。
IVF能够获得成功的大前提是获得可以进行移植的优质胚胎，COH 的目的就是提供高质量的卵子以获得更多的优质胚胎，从而提高成功率。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
玻璃化冻融后单个囊胚移植周期的临床结局分析
玻璃化冻融后单个囊胚移植周期的临床结局分析朱莉;丁晨晖;李涛;曾艳红;刘瑜亮;徐艳文;周灿权【期刊名称】《生殖医学杂志》【年(卷),期】2013(22)8【摘要】Objective:To evaluate the influencing factors of single blastocyst transfer in frozen-thawed cycles.Methods:A total of 109 cycles with single blastocyst transfer after thawing were analyzed in the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from January 2011 to August2012.Among these cycles,48 blastocysts were frozen on D5 after insemination (D5 group) and 61 were frozen on D6 (D6group).Results:Implantation rate in D5 group was significantly higher than D6 group (45.83％ vs.24.59％) (P＜0.05).The abortion rate in D5 group was higher than D6 group (9.09％ vs.26.67％),but no statistical difference was found (P ＞ 0.05).The logistic regression analysis showed that neither blastocysts developmental stage,nor morphology of inner cell mass or trophectoderm was significantly related to implantation potential (P ＞0.05,95％ CI 0.879-3.061,0.318-3.184,0.328-1.362respectively).However,blastocysts developmental stage on D6 was significantly related to implantation potential(P＜0.05,95％ CI 1.080-10.013).Conclusion:Clinical outcomes of D5 single blastocyst transferred cycles were better than D6 blastocysts.D6 blastocysts expansion may be the most important parameter when a single blastocyst is selected fortransfer.%目的分析玻璃化冻融后单个囊胚移植周期中妊娠结局的影响因素. 方法回顾性分析中山大学附属第一医院2011年1月至2012年8月的109个单个冻融囊胚移植周期资料.根据囊胚玻璃化冷冻时的受精天数,将其分为2组:D5单囊胚移植组(n=48)、D6单囊胚移植组(n=61).比较两组的胚胎复苏率、植入率和流产率,并分析囊胚形态参数预测胚胎植入潜能的价值. 结果 D5单囊胚移植组的植入率为45.83％,D6单囊胚移植组为24.59％,两组比较有统计学差异(P＜0.05).D5移植组的流产率有低于D6移植组的趋势(9.09％ vs.26.67％),但差异无统计学意义(P＞0.05).Logistics回归分析结果显示,囊胚分期、内细胞团和滋养外胚层形态均与植入潜能无显著相关性(P＞0.05,95％CI分别为0.879～3.061、0.318～3.184和0.328～1.362).然而分别对D5与D6囊胚进行分析,结果显示D6囊胚扩张程度与植入潜能相关(P＜0.05,95％CI 1.080～10.013). 结论 D5单囊胚移植结局优于D6单囊胚移植；D6囊胚的发育速度与囊胚的植入潜能相关.【总页数】5页(P579-583)【作者】朱莉;丁晨晖;李涛;曾艳红;刘瑜亮;徐艳文;周灿权【作者单位】中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080;中山大学附属第一医院生殖中心,广州 510080【正文语种】中文【相关文献】1.三种不同内膜准备方案在玻璃化冻融囊胚移植周期中的应用 [J], 张玉婷;苏迎春2.低等级胚胎囊胚培养及冻融周期移植后临床结局分析 [J], 王雅琴;杨菁;徐望明;吴庚香3.新鲜囊胚与玻璃化冷冻囊胚复融周期移植的临床结局比较 [J], 何巧花;李杭生;张国玲;张翠莲;崔世红4.冻融周期单个优质囊胚移植后妊娠结局 [J], 贾楠; 殷宝莉; 韦多; 郝好英; 张翠莲5.二次玻璃化冻融囊胚对临床结局和新生儿结局的影响 [J], 韩潇;毕钡钡;黄鲜菊;胡琳莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响
不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响王星星;江莉;毛文琪;张季阳;翟丹梅;杭馥;陆丹【摘要】目的比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响.方法辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚,其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期,解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚;程序化冷冻复苏506个周期,解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚.比较两种方法的复苏效果及临床结局.结果玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02％、92.11％,高于程序化冷冻组的79.68％、69.63％(P＜0.05);两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率,胚胎利用率高,两种冷冻方法的临床结局相似,适用于人类胚胎的冷冻.【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2016(038)002【总页数】3页(P175-177)【关键词】胚胎冷冻;玻璃化冷冻;程序化冷冻;胚胎移植;妊娠结局;复苏【作者】王星星;江莉;毛文琪;张季阳;翟丹梅;杭馥;陆丹【作者单位】广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021;广西医科大学第一附属医院生殖中心,南宁市530021【正文语种】中文【中图分类】R711.6在人类辅助生殖技术中，胚胎冷冻技术旨在经过冷冻和复苏后，胚胎仍能保持原有的生物学活性。
胚胎冷冻技术提高了每一卵巢刺激周期累积妊娠率，减少多胎妊娠率，预防卵巢过度刺激综合征。
针对D3卵裂期优质胚胎和非优质胚胎培养形成囊胚率与临床价值的分析
针对 D3卵裂期优质胚胎和非优质胚胎培养形成囊胚率与临床价值的分析摘要：目的：分析D3卵裂期优质胚胎与非优质胚胎继续培养形成囊胚的几率与临床价值。
方法：收集243个体外受精—胚胎移植(IVF—ET)与卵胞浆里单精子注射—胚胎移植(ICSPET)治疗周期里面被受精的D3（第三日）移植、冷冻存储后余下的优质胚胎202枚、非优质胚胎264枚持续进行胚胎培养，对比双方胚胎囊胚形成几率。
对于玻璃化冷冻中出现的囊胚，若患者新鲜周期未能成功移植妊娠，需选择下一周期解冻、移植囊胚，并对比两种冻融囊胚种植率、妊娠率。
结果：在囊胚形成率比较中，D3卵裂期优质胚胎与非优质胚胎分别为88.37%、4.42%，且P<0．01；且优质胚胎与非优质胚胎在下一周期移植解冻的囊胚量及种植率、妊娠率分别为39与32枚、42.37%与39.65%、63.53与58.78%，数据差异无统计学意义，P>0．05。
结论：一是，在囊胚培养形成率方面，D3优质胚胎比非优质胚胎高；二是，冻融后移植的卵裂期优质胚胎及非优质胚胎形成的囊胚在种植率、临床妊娠率比较差无显著差异。
关键词：D3卵裂期优质胚胎；费优质胚胎；囊胚引言：体外受精-胚胎移植治疗主要以胚胎形态学实施评分，实践中会对择优胚胎进行宫腔移植，其余胚胎会被存储或遗弃。
但研究发现，胚胎形成学无法有效评估胚胎发育潜能，因此可选择D3卵裂期移植剩下的非优质/优质胚胎持续培养，分析囊胚形成情况及玻璃化冷冻形成囊胚，然后可选择下一周期解冻、移植，对比种植率等，从而明确非优质胚胎继续培养囊胚的价值，这样可为临床培养非优质胚胎囊胚提供帮助。
（一）临床资料及方法1、临床病例整理整理我院2020年~2022年采取IVF—ET与ICSPET243个治疗周期的患者胚胎，优质胚胎供应者平均年龄为（31.55±7.55）岁，共计202枚优质胚胎，受精D3移植后平均内膜厚度为（9.25±2.55），平均移植（1.40±0.25）枚；非优质胚胎供应者平均年龄为（32.55±8.55）岁，共计264枚，受精D3移植后平均内膜厚度为（8.55±2.55），平均移植（1.35±0.15）枚。
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景_孙志宏
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景延安大学生命科学学院(延安716000) 孙志宏 马 莉 周茂林 综述 李延清 审校 1983年Tr ounso n等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。
目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。
本文就胚胎冷冻技术基本原理、研究进展与应用前景做一综述。
1 胚胎冷冻保存原理及其损伤机制1.1 胚胎冷冻保存原理 冷冻保存(cr yo peserv ation),是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速度降至零下某一温度,对其长期保存的过程[2]。
此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,从而达到长期保存的目的。
胚胎冷冻技术是在精子冷冻保存的基础上发展起来的。
冷冻胚胎存活率是渗透压和低温损害积累结果的反映。
冷冻保护液的浓度和植冰温度之间确定最适宜的关系是保证冷冻胚胎存活的关键因素[1]。
1.2 胚胎冻存的损伤机制 胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程,冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。
正常胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中,胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶,一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤(ice damag e),另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高,造成蛋白质变性即溶液损伤(solutio n damag e),二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡。
但是,如果在胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的冷冻保护剂如甘油、DM SO、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤[3-4]。
冷冻保护剂的成分通过细胞膜进入细胞内,细胞内外冷冻保护剂和其它溶质达到平衡,同时细胞脱水形成玻璃化的凝固状态,该过程是胚胎冷冻最重要的保护机制。
解冻时,冷冻保护剂渗出细胞外,同时细胞膜必须防止水过多过快渗人细胞内,以免发生渗透性膨胀。
2 冷冻保护剂的种类极其作用机制 在胚胎冷冻和解冻过程中的适当阶段添加适当浓度的冷冻保护剂能有效地降低对细胞的损伤,科学选用冷冻保护剂在胚胎冷冻保存过程中非常重要[5]。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
➢ 冷冻过程
快速冷冻法
由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。
一步冷冻法
牛和山羊目前仍处于试验阶段
牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。
非渗透性保护剂
这是一类大分子化合物，能溶于 水，性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻 保存
➢ 卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵
1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
➢ 卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级：
1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。
2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有
➢ 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
➢ 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。
➢ 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况：
玻璃化冷冻
玻璃化冷冻
1、玻璃冷冻原理：采用了更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温使细胞内外液体均达到玻璃化状态。
2、玻璃冷冻分两步骤：将胚胎放入较低浓度冷冻保护剂中平衡，此过程我们可以看到细胞体积先缩小然后又重新扩大的变化。
然后将胚胎置入含较高浓度冷冻保护剂短暂平衡后，投入液氮。
3、冷冻保护剂可分为渗透性保护剂（细胞内冷冻保护剂）和非渗透性保护剂（细胞外冷冻保护剂）。
4、溶质效应：细胞外水溶液渗透压的升高会对细胞造成损伤。
5、渗透性休克：如果将胚胎直接置于相当于人体组织液渗透压的培养液中，细胞外的水分将快速进入细胞，而细胞内冷冻保护剂渗出细胞外的速度远比不上水进入细胞的速度，将造成细胞体积急剧增大甚至破裂，这种损伤称为渗透性休克。
玻璃化冷冻胚胎、配子及卵巢组织安全性研究进展
等， 细胞 外冷 冻保 护剂有 蔗糖 、 藻糖 等 。多数学 者 海 认为 Ｅ Ｇ加上 大分 子糖 类 是最 广泛 使 用 的 比较 理 想 的冷冻保 护剂 ［。 ３ ３
是 ４ ．＋ ， ３．＋ ．。认 为透 明带外 表小 孔 直径 ５ ７３和 ８２ ８ ４ ２
变 小 、 目减 少对 抵抗病 原 菌入侵 有利 ， 数 但对 胚胎 从
构重新 恢 复到 原来 的状 态 ，有 些胚 胎 出现严 重 的损
很 短 ， 安全 性 一 直 受 到 关 注 ， 文就 近年 来 玻 璃 其 本
化 冷冻技 术冷 冻胚 胎及配 子 的安全 性研究 综述 。 玻璃 化冷 冻损 伤 因素
高浓度冷冻保 护剂和低温会 对配子 、 胚胎 及卵巢 组织造成 化学和物理损伤 。 化学损伤是指 冷冻保护剂 的细胞 毒性作用 ； 物理损 伤是指细胞 内水份在 降温 时 形成冰 晶对 细胞膜 、 细胞器 的机械性 损伤 ， 降温 、 以及 复温 时细胞 内外渗透压改变 而造成 的渗 透 ｌ损伤 。 生 故 需对冷冻保护剂 和降温复温速 率进行优 化。 玻 璃化冷 冻保 护剂 及载 体 的选择 快速 降 温有 利 于玻 璃 化形 成 ， 以为 提 高热 传 所 导性 采 用 各 种 载体 ， 主要 有 麦 管 、 细麦 管 （ 放 、 拉 开 封 闭 ）拉 细 玻璃 管 、 环 、 、 铜 尼龙 环 、 电子 显 微 镜栅 以 及无 载 体 微 滴 法 ； 常用 细胞 内冷 冻 保 护 剂 有 ： 甲 二
外 部摄 取 营养 物质 有 害 ， 其对 培 养 ４ 胎更 有 尤 ８ｈ胚 害 。 以此 解释 培养 ２ ，８ 并 ４ ４ ｈ胚胎 存 活率不 同 ， 速 慢
冷 冻组 、 璃 化 组 、 照 组 分 别 是 ：４ｈ３ ％ ，７ 玻 对 ２ ９ ２ ％，
胚胎冷冻原理和方法
胚胎冷冻方法包括：
1、程序冷冻法：也称平衡冷冻法，是将胚胎放入冷冻液中，慢速降温至一个较低的温度，约在-35℃到-80℃的阶段，然后将它放入液氮中，是早期冷冻时主要采用的一种方法，但程序冷冻的降温过程较长，其中胚胎细胞内的水分易在此过程中形成冰晶，在解冻复温时也有形成冰晶的风险，冰晶会机械性损伤细胞膜和细胞器的膜结构，挤压细胞的骨架，对胚胎造成冷冻损伤，因此在程序冷冻过程中，细胞受到损伤的程度较大，复苏率约在70%；
2、玻璃化冷冻：近20年在程序冷冻的基础上又进一步突破，出现了新的冷冻方法，称为玻璃化冷冻，此方法主要是采用更高浓度及极其黏稠的冷冻保护剂处理胚胎，使胚胎在冷冻的过程中，从生理温度急速降温到-196℃，胚胎细胞内外液体瞬间冻结成玻璃化固体状态。
与程序冷冻法相比，玻璃化方法冷冻过程中，胚胎细胞内的液体不会形成冰晶，从而避免了冰晶对胚胎细胞的物理化学损伤，获得了较好的冷冻效果，玻璃化冷冻胚胎复苏率通常达到95%以上，若冷冻囊胚，效果则更好，复苏率可达到99%以上，显著的高于程序冷冻方法，优势也较明显，所以越来越多的中心逐步开始使用玻璃化冷冻方法，也成为现阶段胚胎冷冻的主要方法。
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识（2023年）摘要人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分。
由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，参考最新国际指南和共识，结合中国临床实践现状，经充分讨论后形成该共识，旨在加强玻璃化冷冻技术质量控制，进一步改善卵母细胞及胚胎冷冻结局，提升辅助生殖服务质量。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要环节。
相较于传统的程序化冷冻，玻璃化冷冻技术以其简单快速、不依赖昂贵设备，且复苏率极高的显著优点，在国内外各大生殖医学中心迅速普及推广，从而为人类生育力保存、胚胎植入前遗传学检测以及全胚冷冻策略的广泛临床应用，提供了必要的核心技术支持。
卵母细胞及胚胎的冷冻复苏结局受诸多因素影响，包括冷冻保护剂种类、样本平衡时间、降温/升温速率和冷冻载体类型等，造成各生殖中心间冷冻结局的差异。
有鉴于此，参考最新指南和共识［1-7］，结合中国临床实践，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，组织本领域专家对人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻技术流程和细节进行归纳总结，以期提供一套全面系统的玻璃化冷冻操作规范指导意见，提升生殖医学中心服务质量。
一.人员资质培训初学者培训采用导师负责制，以经验丰富的胚胎学家作为指导老师，由指导老师依据质控指标和经验判断初学者达到标准后，方可进入下一阶段培训。
整个培训过程形成书面记录存档。
1.理论学习：初学者应理解玻璃化冷冻的基本原理，掌握冷冻保护剂浓度、操作温度、降温/升温速率等基本概念及控制方法［8］。
2.动物样本：建议初学者在指导老师监督下使用动物样本进行为期1~2个月的培训。
以小鼠8-细胞胚胎为样本不断练习冷冻和解冻操作，以熟练掌握试剂耗材的使用方法［8］。
鉴于小鼠胚胎对冷冻和解冻操作的敏感性低于人类胚胎［9］，建议对初学者的要求设为操作50例小鼠8-细胞胚胎的复苏率不低于同中心人类卵裂期胚胎（第3天）复苏率，且复苏后的小鼠8-细胞胚胎需继续培养24~48 h，其囊胚形成率应≥80%［10］。
D3卵裂期胚胎玻璃化冷冻技术在IVF实验室中的应用
D3卵裂期胚胎玻璃化冷冻技术在IVF实验室中的应用摘要】目的：比较分析程序化冷冻复苏技术以及玻璃化冷冻复苏技术在D3卵裂期胚胎保存中的应用价值。
方法：选取72例患者（共140枚胚胎）作为研究对象，对照组采用程序化冷冻复苏技术进行保存，观察组采用玻璃化冷冻复苏技术进行保存，对比两种冷冻技术的应用价值。
结果：观察组的存活率为100%，完好率为98.57%，妊娠率50.98%，种植率为30%，明显好于对照组的91.43%、65.71%、35.29%，18.75%，差异明显，有统计学意义（P<0.05）。
结论：与程序化冷冻技术相比，玻璃化冷冻技术对于D3卵裂期胚胎保存的应用价值更高，值得在临床上推广使用。
【关键词】玻璃化冷冻；程序化冷；胚胎保存【中图分类号】R714.8 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）20-0060-01卵裂期胚胎冷冻是辅助生殖技术中必不可少的重要方面，卵裂期胚胎冷冻技术的有效应用可以帮助患者在一个超促排卵排周期完成多次移植，从而有效提高单个助孕周期的累积妊娠率，同时可以最大程度地减少胚胎的浪费。
本文应用回顾分析法对本院生殖中心2017年8月—2018年4月本院生殖中心进行冻胚复苏移植的72例患者（共140枚胚胎）进行冷冻复苏的具体临床资料进行分析，旨在比较分析程序化冷冻技术以及玻璃化冷冻技术在D3卵裂期胚胎保存中的应用价值。
1.资料与方法1.1 一般资料选取2017年8月—2018年4月本院生殖中心进行冻胚复苏移植的72例患者（共140枚胚胎）作为研究对象，按照冷冻技术的区别分为观察组和对照组，每组均70枚胚胎，其中对照组共34例患者，年龄24～39岁，平均年龄（32.67±3.32）岁；内膜厚度平均（9.21±1.59）mm；移植个数平均为（2.31±0.68）个。
观察组共38例患者，年龄25～40岁，平均年龄（32.84±3.29）岁；内膜厚度平均（8.97±1.38）mm；移植个数平均为（2.29±0.71）个。
胚胎冷冻保存技术
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹 住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速 通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液 形成冰晶，称之为植冰。
目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰 迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给 胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫 升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至 －6℃左右时，用上述方法诱发结冰。
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
损伤保护
• 诱发结晶
在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈 的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发 方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液 上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，
降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使
胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形
成。
特点：分子量大，不进入细胞
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相 时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外 表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚 细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。
冷冻过程
三，保存 • 常规冷冻法
• 一步冷冻法
• 玻璃化冷冻法
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并
产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20-25℃），
胚胎冷冻保存技术的用途
胚胎冷冻保存技术的用途一、前言胚胎冷冻保存技术是一项重要的生殖医学技术，可以帮助不孕夫妇实现生育愿望。
本文将从多个角度探讨胚胎冷冻保存技术的用途。
二、不孕症治疗1. 辅助生殖技术胚胎冷冻保存技术是辅助生殖技术中不可或缺的一环。
在体外受精后，将优质的胚胎通过冷冻保存，可以在后续周期中进行移植，提高成功率。
同时，对于那些需要进行多次取卵才能获得足够数量的卵子的女性来说，将多余的优质胚胎保存起来也是非常有必要的。
2. 预防并发症在辅助生殖技术过程中，由于荷尔蒙治疗等原因可能会导致卵巢过度刺激综合征（OHSS）等并发症。
此时，将优质的受精卵或早期胚胎进行冷冻保存，在患者恢复后再进行移植，可以有效降低并发症的风险。
三、家庭计划生育1. 家庭计划生育胚胎冷冻保存技术也可以用于家庭计划生育。
对于那些希望延迟生育时间的夫妇来说，可以将优质的胚胎冷冻保存，等到合适的时间再进行移植。
2. 遗传病筛查通过基因检测技术，可以对受精卵或早期胚胎进行遗传病筛查。
如果发现存在遗传病风险，可以选择将优质的受精卵或早期胚胎进行冷冻保存，等到进行基因编辑或其他治疗手段后再进行移植。
四、科学研究1. 生殖医学研究通过对冷冻保存的胚胎进行长期观察和分析，可以更深入地了解人类早期发育过程中的分子机制和细胞信号通路等方面的问题。
2. 动物模型建立在动物模型建立方面，通过将优质的受精卵或早期胚胎进行冷冻保存，在后续实验中进行移植，可以有效地建立动物模型，并为相关疾病的治疗提供有力的支持。
五、结语胚胎冷冻保存技术是一项非常重要的生殖医学技术，其应用范围广泛，包括不孕症治疗、家庭计划生育、遗传病筛查以及科学研究等方面。
未来，随着相关技术的不断发展和完善，相信胚胎冷冻保存技术将会在更多领域发挥重要作用。
玻璃微细管法玻璃化冷冻囊胚复苏成功妊娠并分娩
３或 ３ ） ～４级的胚胎继 续培 养 ， 形成 扩张囊胚 ， 依据 Ｇ ｒｎｒ ａ ｅ ｄ
早破 剖宫分娩一 健康 男婴 ， 体重 为 ２９０ｇ 其 它各 项 生理指 级。 １２２ 囊胚的 玻璃 化冷冻 与解 冻过程 ： ．． 囊胚首先在含 自身血
冯贵雪 方伟芬
周 红 刘 茵
清的 Ｐ Ｓ中清洗两次 ， Ｂ 再移入含 １ ％乙二醇（ Ｇ） １ ％二 甲 ０ Ｅ 和 ０ 亚砜 （ Ｍ Ｏ 的平衡液 Ｖ ＤＳ ） １中充分平衡 １ｍｎ 然后 转入含 ２ ％ ｉ， ０ Ｄ Ｏ ２ ％Ｅ ＭＳ 、０ Ｇ和 ０５ ．Ｍ蔗糖 的冷冻 液 Ｖ ２中 ３ｓ再 用 自制 的 ０，
了囊胚玻璃化冷冻获得 健康 婴儿 以来 ， 囊胚 的玻 璃化冷 冻技
术成为 了研究热点 。２Ｏ Ｏ４年 １ 月以来 ， １ 我们 开始对在我 院生 殖 中心接受 体 外受 精． 胎 移植 （ｎＶｔ ｅｔ ￣ｉ ｎ ｍ 胚 Ｉ ｉｏＦｒ！ ｔｎａｄＥ ． ｒ ｉ ｏ ｉ ｂｙ Ｔａｓ ｒＩＦＥ ） 卵胞 浆 内单精 子 显微 注射 （ｎ ａｙ ． ｒ ｒ ｆ ； ．Ｔ 和 ｏ ｎｅ Ｖ Ｉｔ ｃｔ ｒ ｏ ｐ ｉ Ｓｅ ｊｃｏ ；Ｃ Ｉ的部分胚胎 进行囊胚培养 ， ｌ ｃ ｐｒ Ｉ ｅｔｎ ＩＳ） 踟 ｍ ｎ ｉ 用玻璃 微细管（ ｌ ｓＭｃｏｉ ｔ ； ） Ｇａ ｉ ｐ ｅｅ Ｇ 法玻璃化冷冻囊胚 ， ２Ｏ 年 ｓ ｒ ｐｔ 至 Ｏ６ ６月已复苏囊胚 ６ ， 枚 移植 ５枚共 ４例次 ， ２例临床妊娠并 获 有正常婴儿分娩 ， 此属 广西首例。现小结如下 。
麦管。Ｋｓｉ ａａ等 研 究 发 现 随着 温度 升 高保 护 剂毒 性 增 强。
据此 。 我们采 用 Ｇ Ｐ法在室温下操作 。 Ｍ 冷冻过程 中， 我们先用低浓度抗冻保 护剂预处理 囊胚 ， 使 抗冻保护剂充分渗透到囊胚 内部 ， 然后 再移入 高浓度 玻璃化 溶液 中平衡 ， 短时 间 内细胞 高度脱水后 冷冻 保存。这 种做法 既能使抗冻保护剂向细胞 内部充 分渗透 、 又能 降低高 浓度玻 璃化 溶液的化学毒 性的损 伤 ， 同时还能很 好地形 成玻璃 化状 态。 提高冷冻解冻后 的囊胚存 活率。解冻 时梯度 递减法 能有 效脱出抗冻保护剂 。 以解除其对囊胚 的化学毒性作用 。 １９ 年 Ｍｕ ｉａ ９８ ｌ ｄ 等 报道了玻璃化冷 冻人类胚 胎移植 后 ｍ
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读PPT课件
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。
研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。
“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。
玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。
1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。
目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。
玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。
快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。
玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。
影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括：①冷冻保护剂。
同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。
细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll 等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。
冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；②温度下降速度。
降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体。
对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎，目前常用的有：拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用
戴志俊季钢张芳芳张奕
（合肥市妇幼保健院，合肥230001，安徽）
摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。
方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。
结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。
结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。
关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类
Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi （Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui）Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was
100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were
作者单位：合肥市妇幼保健院
安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001
23.81%(5/21). Conclusion: Vitrification ca n be an effective method for cryopreservating human blastocysts.
Key Words：blastocysts; vitrification; cryopreservation; human
自从1998年Mukaida等首次报到了玻璃化冷冻人类胚胎获得成功以来[1]，玻璃化冷冻技术在临床上得到广泛推广和应用，将胚胎培养至囊胚再行冷冻或移植可以在一定程度上起到筛选作用，改善妊娠结局。
我院生殖中心应用玻璃化冷冻技术保存人类囊胚应用于临床，并取得较满意的结局，总结如下。
1 资料和方法
1.1一般资料2011年1月～10月在合肥市妇幼保健院生殖中心行囊
胚玻璃化冷冻复苏移植的患者12个周期，这些患者新鲜周期放弃移植或移植失败，年龄20～40岁，玻璃化冷冻胚胎解冻后培养2小时选择存活的胚胎进行移植。
1.2试剂和耗材采用日本加藤公司玻璃化冷冻、解冻试剂盒
（Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan）。
冷冻试剂包括平衡液（Equilibration Solution，ES）、冷冻液（Vitrification Solution，VS）；解冻试剂含有解冻液（Thawing Solution，TS）、稀释液
（Diluent Solution，DS）、洗液1（Washing Solution 1，WS1）和洗液2（Washing Solution 2，WS2）；冷冻载体为Cryotop（日本加藤公司生产）。
1.3冷冻胚胎的标准参照本院生殖中心囊胚评分标准，第五、六天
发育到3BB以上的胚胎予以冷冻。
1.4玻璃化冷冻取0.5mlES、VS于Falcon 3037皿内室温（24℃）
下平衡，将胚胎（一次最多3枚）移入平衡液ES中5～20min，然后移入冷冻液VS中，充分混匀后迅速将胚胎置于冷冻载体
Cryotop顶端，并立刻投入液氮中，时间控制在60s内。
1.5胚胎解冻复苏将0.5ml解冻试剂取出在室温下平衡，并取解冻
液TS于Falcon 3653皿中置于37℃预温，将要解冻患者的胚胎从液氮中取出，迅速将Cryotop顶端置于TS中1min，然后在室温下依次将胚胎转入DS、WS1、WS2中3min、5min和5min。
最后将胚胎移入平衡过的培养液中，置于37℃、6%CO2的培养箱中培养2h等待移植。
1.6临床妊娠的确认解冻当天选择存活的胚胎行宫腔内移植，移植
14天后测定血或尿人绒膜促性腺激素水平，阳性者移植30天后行B超下监测，见到孕囊者为临床妊娠。
2结果
2011年1月～10月行囊胚玻璃化冷冻复苏移植的患者12个周期，21枚胚胎解冻后，存活胚胎21枚，胚胎存活率为100%；
每周期移植胚胎1.75枚，共有5例患者获得临床妊娠：其中1例流产，其余4例继续妊娠中，胚胎着床率为23.81%（5/21），临床妊娠率41.67%。
3讨论
胚胎的冷冻保存是人类辅助生殖技术实施过程中一个必不可
少的重要环节，玻璃化冷冻技术是指细胞在高浓度的冷冻保护剂作用下，快速降温，使细胞内外的水分直接形成玻璃态，避免了冰晶的形成对细胞的冷冻损伤。
玻璃化冷冻方法具有简便、快捷、经济等优点，相对于程序化冷冻法需要精密的程序化冷冻仪，且操作复杂，时间长，消耗液氮量大而言具有很大的优势和临床应用价值。
自2000年Yokota等[2]首次报道囊胚玻璃化冷冻后获得临床妊娠，近年来学者们在囊胚期胚胎玻璃化冷冻方面开展相关的研
究，并取得可喜的成绩[3]。
张顺吉等[4]研究表明卵裂期胚胎、囊胚玻璃化冷冻解冻后，虽然囊胚的复苏率（94.12%）略低于卵裂期胚胎（96.76%），无显著性差异，但囊胚的冻融移植妊娠率、着床率均明显高于卵裂期胚胎（75% V 40.94%、50% V 22.37%）。
有学者[5]囊胚期冷冻胚胎在一定程度上减少了可用胚胎的数量，但可以改善种植率和减低多胎妊娠率，同田莉峰等[6]报道的结果一致。
在胚胎冷冻保存方面玻璃化冷冻技术有诸多的优势，但其安全性也值得关注。
本研究中使用的Cryotop载体属于开放式载体，在操作过程中与液氮直接接触，加大了胚胎被污染的风险。
同时由于缺少必要的设备冷冻前未进行人工皱缩，可能会影响冻融移植后的结局。
参考文献:
1Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et a1．Vitrification of human
embryos based on the assessment of suitable conditions．Hum
Reprod,l998, 13:2874-2879．
2Yokota Y,Sato S,Yokota M,et a1.Successful pregnancy following blastocyst vitrification:case report[J].Human
Reproduction,2000,15:1802-1803
3Zhu D,Zhang J,Cao S,et al.Vitrification-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles:time for a new embryo transfer
strategy [J].Fertil Steril,2011,95(5):1691
4张顺吉,林戈,卢光琇等.卵裂期胚胎、囊胚的玻璃化冷冻解冻的妊娠结果分析[J].2011,21(8):955-958
5黄国宁,孙海翔等.体外受精-胚胎移植实验室技术.人民卫生出版社6田莉峰,黄志辉,丁涛等.采用玻璃化冻融囊胚技术临床妊娠7例报道[J].江西医药,2011,46(9):845-847。