药物在肝微粒体酶的体外代谢研究

和安全？（即体外抑制评价和诱导评价, In vitro inhibition or induction study） • 5. 新药前体在何种动物代谢特征与人相似，进而为临床前研究的动物选择提
供依据？（即体外人和动物代谢特征研究, In vitro metabolism profiling in animals and humans）
药物相互作用实验过程
• 采用与代谢稳定性一致孵育体系，冰浴上加入1 µL的一系列浓度的待 测化合物（1、10、100、1000、10000 µM）和1 µL的各特异性探针 底物（空白对照样品不加待测化合物，只加等量溶剂），在37 ℃水 浴中预热5 min，然后冰浴上加入5 µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据 不同的探针底物在37 ℃水浴中孵育10~30 min，加入有机溶剂混匀终 止反应，每个浓度组设3个平行样品。其中待测化合物浓度为0.01、 0.1、1、10、100 µM。反应结束后，采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量，考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
常见P450抑制剂和诱导剂
代谢稳定性评价
• 代谢稳定性考察的是化合物被代谢的难易程度和体外清除率的大小， 常用体外代谢半衰期（T1/2）和固有清除率（CLint）表示。一般通过定 量测定目标化合物在酶孵育体系中的清除情况来计算。
孵育系统
• 每 个 孵 育 体 系 总 体 积 为 200 µL ， 体 系 包 括 0.1 M 的 PBS 缓 冲 液 （pH=7.4）188 µL，NADPH发生系统12 µL。冰浴上将1 ～ 2 µL的药 物加入孵育体系中，在37 ℃水浴中预热5 min；然后冰浴上加入5 µL 的肝微粒体酶，轻轻混匀，置于37 ℃水浴中孵育，在0min ～ 60min 设置5、6个时间点采集样品。待反应完毕之后加入400 µL含内标的冰 甲醇溶液终止反应。实验中加入孵育体系中的药物体积控制在1%以 内，以防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体有灭活作用。
代谢表型实验和结果计算
• 本研究的目的是利用肝微粒体体外代谢孵育体系，通过底物消除法，测定加 入不同选择性化学抑制剂后对药物的代谢消除的影响，考察在肝微粒体中参 与代谢化合物的主要CYP450酶。
• 数据计算：用待测物的消除速率表示药物在微粒体孵育体系中的代谢速率； 抑制率(%)=（1-加入抑制剂样品代谢速率/阳性对照样品代谢速率） ×100%=[1-（阴性对照组浓度-实验组浓度）/（阴性对照组浓度-阳性对照组 浓度）]×100%
代谢表型
• 代谢表型指特定代谢酶对目标化合物代谢相对贡献的测算，以确定参 与药物代谢的主要酶，为预测个体差异和药物-药物相互作用提供依据。 理想的候选化合物的代谢转化是由多种酶介导，并且不是由一个高度 多态性的酶介导。代谢表型主要测定方法包括重组酶、选择性化学抑 制剂、抗体抑制剂三种方法，其中选择性化学抑制剂法以其操作简单、 成本低等优势被广泛应用。
抑制率 %
90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00
0.00
CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4 表型
代谢产物的鉴定
• 采用代谢稳定性一致的孵育体系，通过加一定浓度的药物孵育一定时 间，没有加药物的孵育体系作为空白对照进液质分析，分析鉴定代谢 产物。
结果计算
• 将孵育0 min时间点待测化合物的浓度作为100%，其他孵育时间点的 浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育 时间作线性回归，求算得斜率k，根据公式，T1/2 = - 0.693/k可以计算 得到体外半衰期。肝微粒体中的清除率（CL, mL·min−1·mg−1）= 0.693 / t1/2 (min) × 孵育液 (mL) / 肝微粒体 (mg) 。
P450酶
• 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素P450(Cytochrome P450)氧化酶， 简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中， 是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。
P450酶氧化药物的过程
不同种属的代谢性质评价
• 本研究的目的是采用肝微粒体体外代谢孵育体系研究待测化合物在人、 beagle犬、食蟹猴和SD大鼠肝微粒体中的代谢稳定性，分析待测化合 物在不同种属肝微粒体酶中的代谢半衰期和清除率，并进行CYP450 酶代谢种属差异比较，为后期临床前体内实验的动物选择提供依据。 （实验过程和代谢稳定性实验一致，只是选用的肝微粒体为几种不同 种属）
药物对P450主要酶的抑制和诱导
• 酶抑制和诱导作用是代谢研究的关键，是预测药物-药物相互作用， 评估药物安全性的主要指标。一般通过考察药物对各种酶特异性底物 的代谢速率的影响，得到抑制参数IC50，预测目标化合物对酶的抑制 和诱导作用。
CYP450亚酶的特异性底物及反应条件
• 参照文献，选用的CYP450亚酶的特异性底物及对应的代谢产物、孵育 浓度和时间如下：非那西丁-对乙酰氨基酚 (50 µM非那西丁孵育30 min，CYP1A2，脱烷基反应)； 甲苯磺丁脲-4-羟基甲苯磺丁脲（100 µM甲苯磺丁脲孵育30 min，CYP2C9，4-羟基化）；奥美拉唑-5-羟基化 奥美拉唑（20 mM 奥美拉唑孵育20 min，CYP2C19，4-羟基化）；右 美沙芬-右啡烷（150 µM右美沙芬孵育10 min，CYP2D6，O-去甲基）； 右美沙芬-N-去甲右啡烷（50 µM右美沙芬孵育10 min，CYP3A4，N-去 甲基），氯唑沙宗-6-羟基氯唑沙宗（100µM）。氯唑沙宗孵育30min， CYP2E1)。
或由还原辅酶Ⅰ供给，NADH-细胞色素b5还原酶传递，激活分子氧成 两个离子氧。 • 氧化：一个离子氧使药物氧化，另一个与氢结合成水。同时，P450Fe2+失去一个电子，而氧化再生成P450- Fe3+ 。因此可被反复利用用而 起催化作用。
药物与P450酶的关系
• 酶的底物（substrates ）：由P450酶代谢 • 酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或
谢谢大家
数据处理
• 用各模型底物的代谢物的生成量反映肝微粒体孵育体系中各CYP450亚型酶的 活性；设定不加待测化合物的代谢底物的孵育体系中各同工型酶活性为100%， 作为对照组；将含不同浓度抑制剂时反应中代谢产物的生成量与不含抑制剂 时反应中代谢产物的生成量相比得出酶剩余活性，以酶剩余活性为纵坐标， 抑制剂浓度的对数值为横坐标绘制抑制曲线，并用SPSS statistics17.0软件计算 相应的半数抑制浓度(IC50 值)。
5
4
剩余%（LN）
3
2
1
0 0
-1
10
20
30
反应时间（min）
人 犬 猴 大鼠
40
小结
• 通过肝微粒体酶完成上述实验我们能够大概预测一个化合物的半衰期 T1/2、清除率Clint，代谢药物的P450酶亚型，代谢产物鉴定以及共同用 药的时候是否存在药物相互作用等，为药物的前期筛选、结构改造以 及后期的动物实验提供参考。
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
色谱小组：汤明海 2016.04.28
药物研发过程中可能会遇到的问题
• 在进行新药（包括中药）研发的历程中，您可能会面临和解决这样的问题: • 1. 新药前体是否被肝脏药物代谢酶系统代谢，造成口服生物利用度低下？
（即体外代谢稳定性评价,In vitro metabolic stability study） • 2. 如果新药前体被肝脏显著代谢，是何种酶系参与该新药前体的代谢？（即
体外代谢表型的鉴定, In vitro metabolic phenotype cation） • 3. 如新药前体被肝脏显著代谢，其代谢产物是什么，其毒性或药效如何？
（即体外代谢产物的鉴定, In vitro metabolite identification） • 4. 新药前体是否能抑制或诱导肝脏药物代谢酶系，进而影响其它药物的药效
• 复合：药物首先与氧化型细胞色素P450 Fe3+结合成复合物。 • 还原：P450 Fe3+-药物接受还原辅酶Ⅱ提供的电子，由辅酶Ⅱ细胞色素
C还原酶传递，还原成P-450 Fe2+药物。 • 接受一分子氧：P450 Fe2+药物中的低铁血红素能与分子氧结合。 • 再接受电子还原： O2—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供
本身代谢减慢,占代谢性相互作用的70% • 酶的诱导剂（inducers）：药酶活性增强，使其他药物或
本身代谢加速，占代谢性相互作用的23%
主要的P450酶
• 涉及药物代谢的CYP主要为CYP1、CYP2、CYP3 3个家族中7种重要 的 亚 型 ： CYP1A2 、 CYP2B6 、 CYP2C9 、 CYP2C19 、 CPY2D6 、 CYP2E1和CYP3A4