研究生 蛋白质技术

Affinity chromatography
Possible elution strategies:
pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog
Ni-NTA columns
The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:
Ion-Exchange chromatography
+ +
If pH mobile phase =7.2 Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
+ + + +
+ + +
-
+ + +
+ + + + + + +
-
+
Anion exchange column = + charged
3. 细分级分离（fine fractionation） 细分级分离（ fractionation） 主要方法： 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析等
1. 蛋白质的层析分离
层析（chromatography） 层析（chromatography）
凝胶过滤的注意事项
1. 要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过 要根据待分离物质的分子量， 滤基质； 滤基质； 2. 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离， 可用于疏水性分子的分离， 可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析” 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 3. 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 4. 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1 上样量一般在柱床体积的 5. 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过 凝胶过滤的样品浓度越大越好， 样品浓度越大越好 100mg/ml。 100mg/ml。
Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand
3- Elute
2- Wash away non bound sample components from solid support
相对离心力/ 相对离心力/×g 1 000 4 000 15 000 30 000 100 000
时间/min 时间/min 5 10 20 30 3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞 溶酶体、 碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation） 粗分级分离（ fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法， 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与 其它杂蛋白分离开来。 其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分 常用方法：盐析、等电点沉淀、 离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（ 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液 ），又能浓缩蛋白质溶液。
1. 离子交换层析
离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（ 交换剂） 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。 目的，属于吸附层析。 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 离子交换层析的固定相称为离子交换剂， 基团两部分组成 两部分组成。 和基团两部分组成。 ① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯乙烯苯等高分子聚合物； 乙烯苯等高分子聚合物； ② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分 基团：共价结合在基质上的带电基团， 正电基团和负电基团。 为正电基团和负电基团。
1- the strength with which these ions are held to the NTA resin
NTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere
固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（ 固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如 吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的 ），能与待分离的 吸附剂，凝胶，离子交换剂等）， 化合物进行可逆的吸附 溶解，交换等作用 化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 可逆的吸附， 等作用。
流动相：在层析过程中， 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂， 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时 称为展层剂。 称为展层剂。
Affinity chromatography
Commonly used affinity columns:
Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione binds to GST Protein A or G binds antibodies
蛋白质的检测方法
蛋白质的活性检测方法：必须快， 蛋白质的活性检测方法：必须快，必须是特异 性的 蛋白质的免疫学检测方法：western-blot，前提 蛋白质的免疫学检测方法：western-blot， 是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
1. 前处理（取决于采用的材料） 前处理（取决于采用的材料） 动物材料处理： 动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织 种子处理：去种皮， 种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂 动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 动物细胞破碎：匀浆器、 植物组织：研磨， 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶 细菌破碎：超声波， 如果蛋白质定位于某一细胞器， 如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法 将其分离。 将其分离。
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的 样品的生物活性为依据的分离方法。 为依据的分离方法 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合， 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固 定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。 定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
怎样纯化蛋白质？ 怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 来分离或纯化它。 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质…… 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 可溶性： 等电点：离子交换层析 等电点： 分子大小：凝胶过滤层析 分子大小： 生物学性质：亲和层析 生物学性质：
怎样纯化蛋白质？ 怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 来分离或纯化它。 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质…… 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 可溶性： 等电点：离子交换层析 等电点： 分子大小：凝胶过滤层析 分子大小： 生物学性质：亲和层析 生物学性质：
利用分子量不同的蛋白质， 利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度 不同来分离蛋白质的方法。 不同来分离蛋白质的方法。 固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构， ），多孔的网状结构 固定相：凝胶颗粒（ bead），多孔的网状结构， 其网孔决定了凝胶的分级分离范围 其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶 分级分离范围， 分离的蛋白质混合物的M 范围， 分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50 G的分离范围是1500～30000。 的分离范围是1500～30000。 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等 Superdex等。
2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions
基因工程中 亲和层析是基因工程 最常用的纯化技术 亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术
在各种表达载体上都带有各种标签蛋白 在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如 标签蛋白， GST-tag、His-tag、V5-tag等 GST-tag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于 鉴定蛋白表达与否，更可用于与之相连的目标蛋 鉴定蛋白表达与否， 白的纯化； 白的纯化； 通过免疫亲和层析技术，只需一步， 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。 有标签的目标蛋白。
Ion-Exchange chromatography
+ +
+
-
+ -
+ + + +
+
+ + +
Cl-
Cl- +
Cl-
+
+ Cl+ Cl-
+
Na+ Na+ Na+ -
Na+Na+
Na+ Na+ Na+ Na+
+来自百度文库
Cl-
+
Increased salt concentration
分步洗脱
梯度洗脱
2. 凝胶过滤层析
chrome意为“色彩” graphy源自希腊文 chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 源自希腊文， 意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。 层析”就是“色谱” 层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1903年创造 年创造， 1941年英国学者 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析， 年英国学者Martin和Synge提出分配层析 提出分配层析， 此后这种方法得到很大的发展。 此后这种方法得到很大的发展。 层析是利用物质在固定相 流动相之间不同的分 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 固定相与 配比例，达到分离目的的技术。 配比例，达到分离目的的技术。
蛋白质纯化的基本设计原则
原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 特异性的蛋白质检测方法 决定了纯化能否成功）； 决定了纯化能否成功） 分级分离，先粗后细； 分级分离，先粗后细； 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
蛋白质的分离纯化 与定性定量分析
什么是蛋白质的分离纯化
分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 纯化：得到单一蛋白的纯品。 纯化：得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质？ 为什么要纯化蛋白质？
研究特定蛋白质的生物学功能（ 研究特定蛋白质的生物学功能（酶、生物活性 蛋白，etc） 蛋白，etc） 制备抗体 蛋白质晶体学研究 研究蛋白质研究蛋白质-蛋白质相互作用