07-6第六章 电子显微镜的冷冻制样技术

冷冻断裂复型样品的图像特点
1.超薄切片的核膜
2.断裂复型的核膜
二、冷冻断裂复型的方法
图示流程
预处理/冷冻固定 预处理 冷冻固定 样品断裂/暴露观察面 样品断裂 暴露观察面 离子蚀刻/表面冰升华 离子蚀刻 表面冰升华 喷镀复型膜/碳 喷镀复型膜 碳、铂金 分离复型膜/网捞 分离复型膜 网捞
三、冷冻断裂复型膜的命名：
金
液 氮
杯
属
第二节 冷冻干燥技术 一、概念： 概念 将新鲜的或经戊二醛固定的样品快速冷冻固定，然后 将新鲜的或经戊二醛固定的样品快速冷冻固定， 转移到真空容器中并保持低温条件， 转移到真空容器中并保持低温条件，使样品中的固态 水直接升华，而达到脱水干燥的目的。 水直接升华，而达到脱水干燥的目的。 优点：能消除表面张力引起的变形， 优点：能消除表面张力引起的变形，避免脱水剂对细胞 成分的抽提，较好地保存可溶性物质。 成分的抽提，较好地保存可溶性物质 冷冻干燥方法： 二、冷冻干燥方法 1.新鲜样品直接冷冻干燥法： 新鲜样品直接冷冻干燥法： 新鲜样品直接冷冻干燥法 预冷却-80 ℃ 预冷却 常规 TEM 包埋 鲜样粘 真空 冷 回 冻 温 在铜片 干燥器 导电 SEM 固 处理 2.有机溶剂取代的冷冻干燥法 有机溶剂取代的冷冻干燥法： 有机溶剂取代的冷冻干燥法 定 真空 回 常规 后续 100% 冷 固定 干燥 温 处理 乙醚 冻
细胞外
E膜 膜
P膜 膜
细胞内
细胞膜的劈裂面模式图
2.膜的劈裂面的命名 膜的劈裂面的命名： 膜的劈裂面的命名 PS面：与细胞质、核质、线粒体基质相邻P膜的亲水面 面 与细胞质、核质、线粒体基质相邻 膜的亲水面 ES面：与细胞外间隙或细胞内间隙相邻的E膜亲水面 面 与细胞外间隙或细胞内间隙相邻的 膜亲水面 PF面：面向细胞外间隙、核周间隙以及线粒体膜间隙的 面 面向细胞外间隙、 疏水层劈裂面（ 膜的疏水表面 膜的疏水表面）。 疏水层劈裂面（P膜的疏水表面 EF面：面向细胞质、核质、线粒体基质的疏水层劈裂面 面 面向细胞质、核质、 膜的疏水表面） 膜的疏水表面 （E膜的疏水表面
预冷 样品室
新鲜 样品
戊二醛 固定
保护剂 处理
冷冻 固定
冷冻干燥 或切片
）液氮直接冷冻法： 2.方法 （1）液氮直接冷冻法 方法： 方法 小块样品用一滴保护剂粘在样品头上， 小块样品用一滴保护剂粘在样品头上， 迅速投入液氮中冷冻固定 液氮中冷冻固定。 迅速投入液氮中冷冻固定。 （2）中间冷媒法：速率高 ）中间冷媒法： 液氮预冷 入 样品投入 中冷冻
取 材 五字 原则
pH值/渗透压 值 渗透压 温度/时间 温度 时间
持续-140 ℃ 持续
第四节 冷冻断裂复型技术
一、冷冻断裂复型技术及其特点：又叫冷冻蚀刻技术 冷冻断裂复型技术及其特点 1.冷冻断裂复型技术 冷冻断裂复型技术： 冷冻断裂复型技术 新鲜样品通过冷冻断裂， 新鲜样品通过冷冻断裂，将断面制成可以反映样品 形态的复型膜，以便在透射电镜下观察的制样技术。 形态的复型膜，以便在透射电镜下观察的制样技术 2.特点： 特点： 特点 •避免化学处理损伤，能更好地保存细胞生活状态； 避免化学处理损伤，能更好地保存细胞生活状态； 避免化学处理损伤 •能显示细胞劈裂面的超微结构，分辨率较高； 能显示细胞劈裂面的超微结构， 能显示细胞劈裂面的超微结构 分辨率较高； •图像立体感强； 图像立体感强； 图像立体感强 •由铂 碳制成的复型膜，耐受电子束轰击，易于长期保存； 由铂,碳制成的复型膜 由铂 碳制成的复型膜，耐受电子束轰击，易于长期保存； •操作简单，样品制备周期短（与超薄切片比较 操作简单， 操作简单 样品制备周期短（与超薄切片比较） 3.应用：研究生物体细胞的膜结构以及非生物类物质结构 应用：研究生物体细胞的膜结构以及非生物类物质结构。 应用 生物体细胞的膜结构以及非生物类物质结构
第一节
冷冻固定
一、冷冻固定及其要素： 冷冻速度、温度和细胞质浓度 冷冻固定及wenku.baidu.com要素： 冷冻速度、 1、概念：在制冷剂的作用下使样品快速冻结、硬化， 、概念：在制冷剂的作用下使样品快速冻结、硬化， 从而保持样品原有的超微结构和化学成分， 从而保持样品原有的超微结构和化学成分，改善某些 物理性质，便于后续处理或观察。 物理性质，便于后续处理或观察。 2、冷冻固定三要素： 、冷冻固定三要素：
1.细胞断裂模式 细胞断裂模式： 细胞断裂模式 P膜 膜 疏水层 E膜 膜
劈裂面
自然断面
N
细胞模式图
细胞断裂面的命名
2.细胞断面： 细胞断面： 细胞断面
自然断面 劈裂面
自然断面：无明显界限的匀质性、细颗粒状处的断面， 自然断面：无明显界限的匀质性、细颗粒状处的断面， 如细胞质、核质以及细胞内外间隙。 如细胞质、核质以及细胞内外间隙。 劈裂面：指有明显界限的“生物膜”处的断面，如细胞膜、 劈裂面：指有明显界限的“生物膜”处的断面，如细胞膜、 线粒体膜、核膜等细胞器的膜。 线粒体膜、核膜等细胞器的膜。 劈裂面的特点：一般沿膜的不同深度、 劈裂面的特点：一般沿膜的不同深度、不同角度以及不同 层次断裂，大面积暴露出各种膜的表面结构。 层次断裂，大面积暴露出各种膜的表面结构。这时可 以观察到利用超薄切片及扫描方法难以观察到的膜层 结构。 结构。
冷冻速度：大于 冷冻速度：大于7800℃/秒，形成的冰晶小于 ℃ 秒 形成的冰晶小于20nm。 温度：低于再结晶点（ 温度：低于再结晶点（ -160 ℃） 细胞质的浓度：浓度高则温差小 不易冻伤。 浓度高则温差小， 细胞质的浓度 浓度高则温差小，不易冻伤。
3.冷冻温度 冷冻温度： 冷冻温度 组织冷冻损伤的温度与细胞质本身的浓度相关。 组织冷冻损伤的温度与细胞质本身的浓度相关 水分结冰时：在-70~-130℃时形成六角形的冰晶 水分结冰时 在 ℃ 在-120~-140 ℃时形成立方形冰晶 当冷冻温度低于-160 ℃时才能形成无定形冰， 时才能形成无定形冰， 当冷冻温度低于 冷冻固定时，必须在瞬间将温度降至 冷冻固定时，必须在瞬间将温度降至-160 ℃， 使细胞内外同时被冻结而形成玻璃态的冰， 使细胞内外同时被冻结而形成玻璃态的冰， 确保细胞生活状态时的形态。 确保细胞生活状态时的形态。 细胞 损伤
PF面 面 外环境 ES膜 膜 E膜 膜 EF面 面 内环境 P膜 膜 PS膜 膜
谢谢大家！
再见！
细胞内开始形成冰晶 冰晶增大的过程 细胞损伤的阶段
再结晶点
全部冻结
细胞浓度越高，冷冻点与再结晶电的温差越小。 细胞浓度越高，冷冻点与再结晶电的温差越小。
（2）冷冻保护剂： ）冷冻保护剂： 作用：增大细胞质浓度，缩小冷冻点与再结晶点的温差。 作用：增大细胞质浓度，缩小冷冻点与再结晶点的温差。 纯水冷冻点为0 再结晶点为-130 ℃； 纯水冷冻点为 ℃，再结晶点为 植物细胞冷冻点-2 再结晶点为-55 ℃； 植物细胞冷冻点 ℃，再结晶点为 含糖原多的细胞冷冻点-15 ℃，再结晶点为 再结晶点为-25 ℃ 含糖原多的细胞冷冻点 常用防冻剂：甘油、葡萄糖、蔗糖、乙二醇、 常用防冻剂：甘油、葡萄糖、蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜
脱水
第三节 冷冻超薄切片技术
一、类型 直接冷冻固定：橡胶、塑料等弹性材料和高分子材料， 直接冷冻固定 橡胶、塑料等弹性材料和高分子材料， 橡胶 生物材料进行X射线微区分析 生物材料进行 射线微区分析 醛固定、冷冻保护：形态研究、细胞化学、 醛固定、冷冻保护：形态研究、细胞化学、免疫化学 二、制作流程： 制作流程 醛类 固定 保护 处理 冷冻 固定 超薄 切片 染色 镜检 回温 后 进行
第六章
一、冷冻制样： 冷冻制样：
冷冻制样技术概述
冷冻制样技术是一种物理制样技术， 冷冻制样技术是一种物理制样技术，用超低温快速冷冻 的处理方法，代替常规的化学处理。 的处理方法，代替常规的化学处理 冷冻固定 冷冻干燥 冷冻超薄切片 冷冻断裂、 冷冻断裂、复型
二、冷冻制样的内容
三、冷冻制样的核心技术：快速冷冻 冷冻制样的核心技术： 1.能保持细胞的原始状态特征和生理活性， 能保持细胞的原始状态特征和生理活性， 能保持细胞的原始状态特征和生理活性 优点： 避免化学处理对细胞成分的损伤与丢失。 四、优点 避免化学处理对细胞成分的损伤与丢失。 2.操作步骤少，时间短，适合快速研究与诊断。 操作步骤少， 操作步骤少 时间短，适合快速研究与诊断。
通用命名法： 3..膜片的命名 膜片的命名： 通用命名法 膜片的命名 E膜—与细胞外间隙或细胞内间隙（包括核周间隙，线粒 膜 与细胞外间隙或细胞内间隙 包括核周间隙， 与细胞外间隙或细胞内间隙（ 体内、外膜之间的腔以及高尔基体、内质网、 体内、外膜之间的腔以及高尔基体、内质网、溶酶 吞饮泡的腔）相邻的一片，也叫做外片。 体、吞饮泡的腔）相邻的一片，也叫做外片。 P膜—与细胞质、核质、或线粒体基质相邻的一片，叫胞质 膜 与细胞质 核质、或线粒体基质相邻的一片， 与细胞质、 片或内片。 片或内片。
常用防冻剂的特性
保护剂
甘油
渗透性
二甲基亚 乙二醇
非渗透性
羟基乙基淀粉 葡萄糖
分子量 92.11 熔点℃ 熔点℃ 20 沸点℃ 沸点℃ 290
78.13 18.5 189
62.07 -11.5 198
450000
6850
二、冷冻固定方法：
1.冷冻固定的基本流程 冷冻固定的基本流程： 冷冻固定的基本流程
4.细胞质的浓度与冷冻保护剂 细胞质的浓度与冷冻保护剂： 细胞质的浓度与冷冻保护剂 （1）细胞质的浓度与冷冻温度的关系： ）细胞质的浓度与冷冻温度的关系： 冷冻点：当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻点。 冷冻点：当细胞内液开始凝固时的温度称为冷冻点。 液共存。 固、液共存 再结晶点：细胞全部冻结成为固态时的温度。 再结晶点：细胞全部冻结成为固态时的温度 冷冻点