固定化酶的生产

酶的固定化技术

摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。

关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞

Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future.

Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell

前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。

一、 酶的固定化方法

酶的固定化方法总体分为：可溶性酶的方法和不溶性酶的方法。

下面将重点介绍可溶性酶的方法： 酶的固定化方法

可溶性酶的方法 不溶性酶的方法

包埋

结合 无衍生作用 衍生作用 凝胶包埋

纤维包埋 微胶

包埋 载体结合 交联 物理

吸附 离子结合 螯合或金属离子结合 共价结合

1、结合法：

1.1载体结合法将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。

1.1.1共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。

1.1.2 离子结合法通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。能引起离子结合的载体,除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较,操作简便,处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响。

最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；

其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。

1.1.3物理吸附法将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有活性炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省,可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。

影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:

1. PH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。

2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。

3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。

4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。

5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。

6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，

要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

1.1.4 螯合或金属结合法这是一种相当新的技术采用过渡金属化合

物作为活化载体表面的手段，这样可通过螯合物形成将酶

等物质直接偶联，而不必预先制备活化的载体衍生物。适

用的载体有玻璃、几丁质、硅藻土、藻酸、明胶、聚（4

和5-丙烯基氨基水杨酸）和纤维素。它们已用于固定酶和

抗生素。

1.2 交联法利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交

联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二

异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参

与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α- 氨基、赖氨

酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联

法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆

弱。

共价交联法的四种形式：

1.2.1酶直接交联法

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。

1.2.2酶辅助蛋白交联

当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。

1.2.3吸附交联法

此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。

1.2.4载体交联法

用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中