一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
TUNEL-roche使用流程
In situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）把荧光素（fluorescein）标记的dUTP（三磷酸脱氧尿甘）连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，HRP又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒红色TRITC标记荧光检
一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（红色 TRITC 标记荧光检测法，通用型）说明书修订日期：2018.07.31 Catalog No.：KGA7061 / KGA7062 / KGA7063Storage：-20℃ for 12 months,避光For Research Use Only（科研专用）一、TUNEL 检测原理凯基一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(TRITC红色荧光标记，通用型)提供一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况，其原理是红色荧光素（Tetramethylrhodamine，TRITC）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3′－OH 末端，可用荧光显微镜检测。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有3′-OH 形成，很少能够被标记。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。
二、TUNEL 试剂盒组分运输及保存条件：2-8℃低温运输，收到后-20℃避光保存，保质期一年。
实验前准备：实验前按说明书准备好相应试剂与器具，多聚甲醛、二甲苯、乙醇、1×PBS pH 7.4、H2O2、Triton X-100、甲醇、多聚赖氨酸铺载玻片（细胞样本）、盖玻片、染色缸、温盒、量筒等。
三、操作步骤各个样本请用免疫组化笔做好标记，另外加 2 张样本切片分别用于阳性片和阴性片制备并做好标记。
在每步反应或浸洗的间隙时，配制下一步即用的工作液。
注意事项反应液最好根椐计算好的样本数量集中配制，再分别滴加于各样本上，避免因每个样本单独配制而产生的试剂损耗，TdT 酶反应液如需短暂保存时，请置于冰上。
tunel法检测细胞凋亡实验步骤
tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。
其中一种常用的方法是使用tunel法。
本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。
实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。
将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。
在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。
例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。
2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。
常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。
将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。
3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。
洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。
4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。
将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。
一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。
5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。
tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。
按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。
反应时间一般为1-2小时。
6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。
然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。
将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。
7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。
可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。
自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。
除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。
下表列出每步所需物品概览：特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。
空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。
两种情况均能产生假阴性。
假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。
两种情况均能产生假阳性。
为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数样本：细胞离心涂片和细胞涂片在chamber slides上培养的黏附细胞冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透检测次数：一个试剂盒50T试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。
1 流程图：2 样品准备2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton1）X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
2.2 组织部分2.2.1 福尔马林-包埋组织福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HR P；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7. 5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）细胞凋亡试剂盒是一种常用的检测细胞凋亡的方法。
本文将介绍TUNEL细胞凋亡试剂盒的内容及操作步骤。
1.引物溶液：含有dUTP（脱氧尿苷三磷酸）的荧光标记的核苷酸。
2.终止缓冲液：用于停止反应和洗涤。
3. TUNEL酶溶液：含有DNA连接酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），用于在DNA断裂的末端添加dUTP标记。
4.正对照组：包括经过DNA内切酶处理的组织切片或细胞，用于确定试剂盒的反应情况。
步骤一：取材将需要检测的组织切片或细胞标本取出，放入离心管或培养皿中。
步骤二：固定用4%的冷乙醇或4%的帕拉醛对组织切片或细胞标本进行固定，固定时间为10-30分钟。
步骤三：洗涤用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤固定的样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤四：蛋白酶消化对组织切片或细胞标本进行蛋白酶消化，以去除背景蛋白质干扰。
消化时间和消化酶的浓度需要根据实验条件进行优化。
步骤五：洗涤用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤六：加入TUNEL酶溶液将TUNEL酶溶液滴加到样本上，保持湿润。
反应时间为1-2小时，可以根据实验需要进行优化。
步骤七：终止反应加入终止液停止反应，并用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤八：显微镜观察将样本用荧光或显色试剂染色，然后用荧光显微镜或普通显微镜观察，并拍摄照片。
步骤九：分析数据使用图像分析软件对显微镜拍摄的照片进行图像分析，在感兴趣区域计算标记的细胞数量，并计算相对细胞凋亡率。
值得注意的是，在进行TUNEL细胞凋亡试剂盒检测时，需要根据实验需要进行优化，如反应时间、荧光染色时间、荧光强度测量等。
此外，为了准确地判断细胞中的凋亡现象，可以与其他细胞凋亡指标一起使用，如Annexin V染色、Caspase活性检测等。
翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。
其原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
TUNEL细胞凋亡检测(荧光标记)操作流程
一、TUNEL实验试剂(1)DeadEnd™Fluorometric TUNEL System试剂盒购自Promega公司(产品编号G3250)(2)二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司（产品编号80139118，CAS号108-38-3，500ml）(3)无水乙醇购自中国上海生工生物有限公司（产品编号ET0737-500ml）(4) 过氧化氢购自上海生工生物有限公司(产品编号H1976-500ml)(5) Proteinase K购自上海生工生物工程技术服务公司(产品编号BSP169-2ml)(6)多聚甲醛购自上海生工生物有限公司（产品编号PB0684-500g）(7) Propidium iodide购自Sigma（产品编号P4170-10MG）(8) SlowFade® Gold antifade reagent购自Life Technologies（产品编号36936）二、具体实验步骤A. 石蜡包埋组织预处理：1.二甲苯5min (500ml二甲苯)2.二甲苯5min（500ml二甲苯）3.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）4.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）5.80%乙醇5min（500x0.8=400ml无水乙醇）6.70%乙醇5min（500x0.7=350ml无水乙醇）7.PBS 5min（500ml）8.PBS 5min（500ml）9.PBS 5min（500ml）10.4%多聚甲醛in PBS，15min11.PBS 5min（500ml）12.PBS 5min（500ml）13.Proteinase K in PBS (100ul每个样品，共6ml), 8-10min14.PBS 5min（500ml）15.PBS 5min（500ml）16.4%多聚甲醛in PBS，5min17.PBS 5min18.PBS 5min共105分钟，实际约2个小时B. 凋亡检测1.每个样品，100ul平衡缓冲液覆盖细胞，室温5-10分钟2.在平衡细胞的同时，在冰上解冻核苷混合物，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应（见4.E节）的rTdT孵育缓冲液。
TUNEL说明书
不适用于诊断，仅供生命科学实验使用。
仅供体外使用。
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（标记POD）本试剂盒可标记DNA链末端，即TUNEL技术。
用于单个细胞水平凋亡（细胞程序性死亡）的免疫组织化学检测和定量分析。
光镜检测。
批号：11684817910一盒可用50次储存：-15—-25℃操作指南2006.01.1.2 试剂盒组成注意事项本品标记溶液含有二甲基砷酸盐，容易被吸入而产生毒性和导致呕吐；也含有二氯化钴，吸入后容易致癌。
因此应避免接触并遵循相关的操作说明。
使用过程中不能吃、喝和抽烟。
如果接触到皮肤，应立即用大量水冲洗干净。
如果感觉不适或者突发其它情况，应立即就医。
酶标反应应在致密的、无损坏的容器中进行，收集上清液后应标明成分。
垃圾应作为有毒废物进行处理。
注意：与先前的试剂盒/管不同，次试剂盒的酶溶解液不再含有毒的二甲砷基酸盐，因此瓶1没有毒性。
试剂盒组成请参照下表对比试剂盒组成试剂盒外自备仪器和试剂出上表所列试剂外，实验者需制备系列溶液。
下表列出了在不同实验步骤中所需要的试剂。
在每步操作前都给出了详细的说明。
2 引言2.1 产品描述实验原理在细胞凋亡过程中，基因组DNA 会断裂产生双链、低分子量的DNA 片段和高分子量的单链DNA 断端（缺口），这些DNA 链缺口可以利用酶标记核苷酸3’末端方法来识别。
应用原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以用来对细胞或者组织中的单个细胞进行检测并定量，因而次法被用在很多分析系统中，例如：●在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片。
●在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性。
●通过双染色操作，确定经历死亡的异常增生细胞的分型。
专一性TUNEL反应可以更好的标记通过凋亡产生的DNA链末端，因此就可以区分出凋亡与坏死，以及由抗肿瘤药物或者放射诱发的初始DNA链末端。
试验干扰假阴性：在某些形式的细胞凋亡中，DNA逃逸酶切或者不完全（37）。
tunel检测说明书
一、TUNEL试剂盒说明凯基一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是绿色荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，可用荧光显微镜检测。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。
本试剂盒特点●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，只需一步染色反应，洗涤后即可观察。
●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
●快速操作：仅需约1-2个小时即可完成整体操作。
●方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果。
●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性●应用范围广：可以用于冷冻或石蜡切片中的组织细胞凋亡检测，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
二、TUNEL试剂盒组分注意事项1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5. 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸。
三、操作流程概览细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本四、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 10），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒产品简介：碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现红色荧光的凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上红色荧光探针Cy3(Cyanine 3)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
本试剂盒有如下优点。
(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色明亮，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。
(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。
(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。
在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。
TUNEL联合免疫组化方法
TUNEL联合免疫组化的实验步骤一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。
2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。
对于石蜡切片：a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b. 滴加20µg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. 用PBS或HBSS洗涤3次。
注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3% H2O2 in PBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。
随后用PBS或HBSS洗涤3次。
注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。
e. 配制生物素标记液：参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。
注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。
f. 样品的生物素标记：1. 在样品上加50µl 生物素标记液，37℃孵育60分钟。
注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。
2. 用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。
3. 用PBS或HBSS洗涤3次。
g. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制： a. Streptavidin-HRP工作液的配制：参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。
注意：配制好的Streptavidin-HRP 工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
h. DAB显色液的配制：按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。
PH1731 TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒显色法
C. 对于石蜡切片： a. 脱蜡，组织切片置于 60℃恒温箱，烤片 30-60min，浸入装有新鲜二甲苯的染色缸，室温放置 15min。浸入另一个装有新鲜二甲苯的染 色缸，重复一次。 b. 洗涤，组织切片浸入 100%乙醇染色缸，室温放置 10min。浸入另一个 100%乙醇染色缸，重复一次。 c. 水化，组织切片浸入梯度浓度乙醇溶液（90%，80%，70%，50%），室温下每步放置 3min。 d. 组织切片浸入 PBS，室温放置 5min。 e. 组织切片用柠檬酸缓冲液（PH=6.2）进行中火修复 5min。（对于有些组织可以用 1xProteinase K 进行通透，即每个组织滴加 50μl 用 PBS 稀释的 1×Proteinase K，室温静置 15-30min，具体通透时间因组织而异，需要自行摸索） 表 1. 准备用于通透的 1×Proteinase K 缓冲液 1×Proteinase K 50×Proteinase K PBS 50ul 反应中所需体积 5ul 45ul 反应数 × × = = 总体积
PH1731 | TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒 （显色法） TUNEL Apoptosis Detection Kit Ver2.0
Catalog No：PH1731 Size： 20T | 50T Store at -20℃
简介
细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。细胞凋亡时抽提 DNA 进行电泳检测，可以发 现 180-200bp 的 DNA ladder。 基因组 DNA 断裂时， 暴露的 3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶 （Terminal Deoxynucleotidyl Transferase， TdT）的催化下加上绿色荧光探针 FITC 标记的 dUTP，之后经过 POD 转换试剂将信号转化成显色反应，方便结果的分析与保存。Tunel 细胞凋亡检测试剂盒不依赖生物素系统进行末端标记，避免了内源性生物素产生的高背景等问题。
TUNEL 法测凋亡操作步骤
TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。
二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
TUNEL原位凋亡检测试剂盒
Va明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
背景介绍 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发挥 着重要的作用。凋亡细胞在形态和生理生化方面会发生一些特征性的改变，比如细胞皱缩， 细胞间连接消失，线粒体膜电位消失，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解 成为约180 bp-200 bp的片段；胞膜有小泡状突起，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞 膜结构仍保持完整，最终凋亡细胞遗骸被分割包裹为几个凋亡小体，并迅速被周围专职或非 专职吞噬细胞吞噬。以上改变发生在不同的细胞凋亡阶段。 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非 常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180 bp-200 bp的整倍数，而这正好是 缠绕组蛋白DNA的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产 生不同长度的寡聚核小体片段。实验表明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶 作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异 的梯状Ladder图谱，而坏死细胞的DNA呈弥漫的连续图谱。 检测原理 本试剂盒采用TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)法，应用末端脱氧核糖核苷 酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂的DNA的3´-羟基 (3´-OH)末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷 (FITC-12-dUTP)。FITC-12-dUTP标记的 DNA可 以 用 荧 光 显 微 镜 直 接 观 察 或 者 用 流 式 细 胞 仪 定 量 。 试 剂 盒 中 的 BrightGreen Labeling Mix包含FITC-12-dUTP以及专利的Bright因子。这种独特的小分子化合物可非共 价的与FITC结合，增强其稳定性，并使其信号放大，从而使得标记物更亮，抗淬灭能力更 强。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤一、试剂盒内容2.终止缓冲液：用于停止DNA链的合成反应，防止假阳性结果的产生。
3.蛋白酶K：用于溶解细胞质膜和核膜，使DNA暴露出来。
4.异硫氰酸荧光素（FITC）标记转移酶：用于检测dUTP与DNA标记的连接。
5.正控组织切片或细胞悬液：用于检验试剂盒的敏感性和特异性。
二、操作步骤1.细胞处理将要测试的细胞分成实验组和对照组，分别处理。
实验组是要测试凋亡的细胞，对照组是不会凋亡的细胞。
2.固定细胞用4%的乙醛或无氧乙醛等适当浓度的固定液固定细胞。
涂片上的细胞需要进行细胞穿孔，可以使用0.1%的Triton X-100进行细胞穿孔。
3.蛋白酶K消化将蛋白酶K溶解在PBS缓冲液中，加入溶液中胶原酶和蛋白酶蚀解，接着加入盛有细胞的离心管中。
将离心管放入37℃恒温水浴中，反应20-30分钟。
4.清洗细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
5.脱水将细胞离心，抽去PBS缓冲液，然后使用3%的过氧化氢来进行脱水。
6.TUNEL染色将细胞加入等量的TUNEL试剂液，轻轻混合后，将离心管放入37℃恒温水浴中，反应30-60分钟。
7.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
8.反应终止使用终止缓冲液反应终止DNA链合成反应，将离心管放入室温中静置10分钟。
9.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
10.展片与观察将细胞滴在载玻片上，并加入封片缓冲液。
在载玻片上覆盖盖玻片，用显微镜观察。
通过上述步骤，可以使用TUNEL细胞凋亡试剂盒对细胞进行凋亡分析。
该试剂盒可根据DNA末端的3'-OH羟基与终止缓冲液中标记的dUTP之间的连接，用显微镜观察细胞内是否存在凋亡现象。
荧光标记的dUTP可通过荧光显微镜直接观察，而酶标记的dUTP则需要加入相应的底物，通过酶的催化反应后可通过光学密度法或荧光显微镜来定量测定。
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一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒产品简介：碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(T dT-mediated d U TP N ick-E nd L abeling)法检测细胞凋亡的原理。
注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。
本试剂盒有如下优点。
(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。
(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。
(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。
(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。
(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。
在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。
在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。
本试剂盒足够检测50个样品。
保存条件：-20℃保存，荧光标记液需避光保存。
注意事项：需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126)，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098)，同时需自备含0.1％ Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)。
如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯。
蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1.对于贴壁细胞或细胞涂片：a.PBS或HBSS洗涤一次。
b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
d.用PBS或HBSS洗涤一次。
e.加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。
f.转步骤5。
2.对于悬浮细胞或细胞悬液：a.收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c.用PBS或HBSS洗涤一次。
d.用含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e.转步骤5。
3.对于石蜡切片：a.二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b.滴加20 g/ml不含DNase的蛋白酶K，在20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c.PBS或HBSS洗涤3次。
注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d.转步骤5。
4.对于冷冻切片：a.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。
b.PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
c.加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。
d.转步骤5。
5.配制TUNEL检测液：6.a.用PBS或HBSS洗涤2次。
b.在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
c.PBS或HBSS洗涤3次。
d.用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。
7. 对于悬浮细胞或细胞悬液：a.用PBS或HBSS洗涤2次。
b.加入50微升TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
c.PBS或HBSS洗涤2次。
d.用250-500微升PBS或HBSS悬浮。
e.此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。
可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长的范围为515-565nm(绿色荧光)。
常见问题：1.出现非特异性荧光标记。
a.有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。
解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b.使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。
建议采用推荐的固定液。
c.TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。
注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
2.荧光背景很高。
a.支原体污染。
请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。
支原体染色检测试剂盒(C0296)可以向碧云天订购。
b.高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
c.TUNEL反应过强。
可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。
稀释后的TdT酶需当日使用。
d.红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
3.标记效率低。
a.使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
b.固定时间过长，导致交联程度过高。
此时宜减少固定时间。
c.荧光淬灭。
Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。
解决方法是需注意避光操作。
d.碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。
碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。
解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
使用本产品的文献：1. Wang Z, Tang X, Li Y, Leu C, Guo L, Zheng X, Zhu D.20-Hydroxyeicosatetraenoic acid inhibits the apoptotic responses in pulmonary artery smooth muscle cells.Eur J Pharmacol. 2008 Jun 24;588(1):9-17.2. Li Y, Li Q, Wang Z, Liang D, Liang S, Tang X, Guo L, Zhang R, Zhu D.15-HETE suppresses K(+) channel activity and inhibits apoptosis in pulmonary artery smooth muscle cells.Apoptosis. 2009 Jan;14(1):42-51.3. Zhang YE, Wang JN, Tang JM, Guo LY, Yang JY, Huang YZ, Tan Y, Fu SZ, Kong X, Zheng F.In vivo protein transduction: delivery of PEP-1-SOD1 fusion protein into myocardium efficiently protects against ischemic insult.Mol Cells. 2009 Feb;27(2):159-66. Epub 2009 Feb 20.4. Li Q, Zhou Y, Yao C, Ma X, Wang L, Xu W, Wang Z, Qiao Z.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage.Parasitol Res. 2009 Nov;105(6):1539-48. Epub 2009 Aug 19.5. 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