达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案 - 生物在线
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
达科为生物技术 人淋巴细胞分离管说明书
1/32/33/3表一：产品基本参数使用方法1.检查。
如图一（A ）所示。
取出分离管，观察半固体材料之上是否有游离的分离液。
如果有，请用离心机2000g ，20℃，离心1min 。
2.倒入血液。
血液样品必须为抗凝全血，无需稀释。
分离液呈半固体形态，不会与血液混合。
每支分离管可以分血分离管组成密度介质医用级别半固体组织分离液密度 1.077±0.001g/mL (20ºC)渗透压290±15mOsm 内毒素含量≤0.25EU/mL 保存条件室温避光保存保质期12个月图一：淋巴细胞分离管分离血液的过程注意事项：�分离管室温避光保存。
�最佳分离温度在18-25℃，超出该温度范围分离效果将受一定影响。
�血液在室温采集、在抗凝容器中室温存放（保存时间不要超过4hr ）、室温分离，勿放到4℃冰箱。
�全血无需稀释，可直接分离。
但稀释后不影响分离效果。
�如果全血不足3mL ，建议不要使用分离管，稀释到3mL 对分离效果没有改善。
因为不论稀释与否，红细胞的数量是恒定的，置换出的游离分离液也是恒定的，经离心后细胞聚集带仍然距离半固体组织很近，吸取操作会有一定难度。
�取走血浆的血细胞可以用生理盐水稀释一倍之后倒入分离管，以分离PBMC 。
但前提是有足够数量的红细胞（至少有相当于3mL 全血所含的红细胞）。
1046-10496.刘义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-6947.张慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-1018.王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-2429.丁隆,等.[J]第三军医大学学报,2007,29(11):1072-107510.夏婷,等.[J]中国实验血液学杂志,2006,14(4):745-74811.陈华华,等.[J]微循环学杂志,2005,15(4):6-812.陈敏,重庆医科大学博士学位论文2007制造商：深圳市达科为生物技术有限公司地址：深圳市南山区南油登良路天安工业区5栋3B (518054)Toll free ：800-8304366Tel ：+8675586235352Fax ：+8675526869149E-mail ：*************http ：//（100413）。
达科为 达优ELISPOT系列说明书-鼠IL-4预包被版
Mouse IL-4 precoated ELISPOT kit说明书Cat# : DKW22-2040-500产品描述：达科为公司生产的达优®系列ELISPOT预包被试剂盒采用原装进口高亲和力高效价抗体对，经预包被PVDF 板、低温冷冻干燥、真空密封包装等工艺流程制备。
成品PVDF板上预包被的抗体分布均匀、效价稳定，2-8 ºC 可存放12个月。
达优®系列预包被ELISPOT试剂盒使实验检测时间从3天缩短为2天，大幅度减少无菌操作的实验步骤，减轻实验者的劳动强度和减少污染的机会。
使得实验者能够轻松、高效地完成复杂的ELISPOT检测实验。
试剂盒提供的试剂、规格：名称规格（5 ×96T）Biotinylated antibody 100μL× 5Streptavidin-HRP 500μLDilution buffer R（10×） 10mLWashing buffer (50×) 25mL×2AEC dilution 25mL×2AEC solutionⅠ（20×） 5mLAEC solutionⅡ（20×） 3mLAEC solution Ⅲ（200×） 500μL预包被PVDF板5块需要实验者自行准备的试剂与仪器：1.RPMI-1640基本培养基（需要添加双抗，不需要添加血清）2.无血清培养基（完全培养基，即用型）3.超净工作台4.CO2细胞培养箱5.微量移液器及配套Tip头6.8通道微量移液器7.0.5mL, 1.5mL EP管8.Biosys Bioreader自动读板仪试剂的配制：1．Washing buffer (50×):用去离子水稀释(1:50)，制成1× Washing buffer备用。
2．Dilution buffer R(10×)：用1×PBS稀释(1:10)，制成Dilution buffer R(1×)备用。
淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[发明专利]
![淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/54d70cb7b8d528ea81c758f5f61fb7360b4c2b81.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101012449A [43]公开日2007年8月8日[21]申请号200610063555.6[22]申请日2006.11.09[21]申请号200610063555.6[71]申请人深圳市达科为生物技术有限公司地址518067广东省深圳市南山区蛇口工业六路科健大厦四楼西[72]发明人朱义鑫 [74]专利代理机构深圳创友专利商标代理有限公司代理人罗瑶[51]Int.CI.C12N 5/06 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 8 页[54]发明名称淋巴细胞分离液及分离脾脏淋巴细胞的方法[57]摘要本发明公开了一种淋巴细胞分离液，所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。
本发明还公开了采用上述分离液分离脾脏淋巴细胞的方法，该方法包括：将脾脏直接在分离液中研磨，制备成单细胞悬液，并将悬有脾脏细胞的分离液进行离心操作。
本发明的分离液及方法无毒、便于操作且易于分离得到的状态好、活力高的淋巴细胞。
200610063555.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述分离液中包含重量体积百分浓度为14.0～17.5％的碘克沙醇(Iodixanol)。
2、根据权利要求1所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的渗透压为230～310mOsm，内毒素含量小于1EU/mL，pH 值为7.0～7.2。
3、根据权利要求2所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液还包含体积百分浓度为70.8～76.7％的RPMI1640培养基以及体积百分浓度为9.3～11.7％的超纯水。
4、根据权利要求2或3所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液的密度为1.077～1.095g/mL。
5、根据权利要求4所述的一种淋巴细胞分离液，其特征在于：所述淋巴细胞分离液用于分离小鼠或大鼠的脾脏淋巴细胞。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。
为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。
本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。
二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。
3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。
ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。
B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。
ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。
iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。
C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。
ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。
iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。
iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。
D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。
ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。
三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。
2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。
3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。
四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。
然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。
可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。
2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。
(完整word)脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。
熟悉细胞分离的基本原理2。
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。
掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。
2%台盼蓝染液8。
显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理
淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞的原理淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离脾淋巴细胞。
通过对淋巴细胞的分离，可以获得纯净的淋巴细胞群体，为后续的实验研究提供了条件。
淋巴细胞是一类免疫细胞，主要存在于淋巴组织和淋巴液中。
淋巴细胞的分离液是一种含有特定成分的溶液，能够有效地分离脾淋巴细胞。
其原理主要包括以下几个步骤：第一步，准备脾组织。
取得小鼠的脾脏，将其置于无菌条件下进行操作。
脾脏是免疫系统的重要器官，其中富含淋巴细胞。
首先将脾脏放入含有冷PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中，并用离心机低速离心，以去除掉其他组织和血管。
第二步，制备单细胞悬浮液。
将脾组织移至无菌的培养皿中，用无菌匀浆棒将组织碾碎。
随后，加入适量的无菌PBS，充分混合，制备出均匀的组织悬浮液。
第三步，加入淋巴细胞分离液。
将淋巴细胞分离液缓慢地滴加到组织悬浮液中，同时轻轻摇动培养皿，使淋巴细胞分离液充分与组织悬浮液混合。
淋巴细胞分离液中的特定成分能够与其他细胞发生作用，使淋巴细胞得以分离。
第四步，离心分离。
将混合液倒入离心管中，用离心机进行高速离心。
离心的目的是通过离心力将淋巴细胞与其他细胞分离开来。
离心结束后，可观察到淋巴细胞沉积在离心管底部，上层液体中则含有其他细胞和杂质。
第五步，收集淋巴细胞。
将上层液体倒掉，只留下沉积的淋巴细胞。
用无菌的PBS洗涤淋巴细胞，去除残留的淋巴细胞分离液和其他杂质。
重复洗涤步骤，可更好地保证淋巴细胞的纯度。
通过以上步骤，我们可以获得高纯度的脾淋巴细胞。
这种分离方法简单易行，操作方便，并且能够得到较为理想的结果。
淋巴细胞的分离液在免疫学和细胞生物学等领域具有广泛的应用价值，为研究淋巴细胞的功能和机制提供了重要的实验手段。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。
因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。
本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。
2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。
2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。
3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。
2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。
2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。
3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。
4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。
2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。
2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。
3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。
3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。
具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。
4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。
通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。
这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。
实验二淋巴细胞分离实验
注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤 注意事项
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周, 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、 血小板 PBMC
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
小鼠淋巴细胞分离方法
小鼠淋巴细胞分离方法一、实验用品的准备：1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20µl枪头、200µl枪头、1000µl枪头。
摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒；2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个；200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个；5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）；注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。
二、相关实验：（一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。
实验动物：BABALB/c小鼠；雌性实验材料：1．小鼠淋巴细胞分离液,2．60mm玻璃培养皿3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌4．气管切开包5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机6．1640培养基实验方法1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。
注意无菌操作。
3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。
4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。
5. 3000转离心15分钟。
（病毒室离心机）6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。
7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。
8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
实验试剂用量：1．小鼠淋巴细胞分离液：60 mL 2．1640基础培养基：80 mL 3．5%FCS1640培养基：50Ml。
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离
小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。
步骤：1.烘烤。
用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。
烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。
2.割尾。
烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。
3.止血。
用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。
要点1.烤：烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。
烤的太过：小鼠死亡。
2.割：割的太浅：血液不流出。
割的太深：鼠尾被割断。
后续应用：取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。
所取血可用于血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。
附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血小鼠脾淋巴细胞分离所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm 中皿及血球计数板一块。
所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。
分离原理示意图图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图分离步骤及要点：1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。
2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。
换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。
脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。
取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。
注意无菌操作。
3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法
小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多种方法，走了不少弯路呢。
我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。
先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。
然后取脾的时候，我就出过岔子。
有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。
我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。
取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。
我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。
经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。
制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。
有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。
刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。
对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。
但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。
后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。
而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。
这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。
还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。
后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。
比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。
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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹 力。 镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑 动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱 鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱 鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘 义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张 慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
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EZ-SepTM 系列说明书
离心机转速换算公式（rpm与g）
在 有 关 离 心 机 的 实验 中， RCF(relative centrifugal field)表示相对离心场，以重力加速度g（980.66cm/s2）的 倍数来表示； rpm(revolution per minute ，或 r/min) 表示 离心机每分钟的转数。rmp与g之间的换算公式为： RCF = 1.119 x 10-5 x (rpm)2 x r
渗 透 压：280±15mOsm 主要成份：Iodixanol，化学惰性，无生物毒性
使用方法：
自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200 目尼龙网——裁 成 90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求） 、其他常用器 材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 实验步骤： 1. 2. 3. 断颈处死小鼠，浸泡于 75%的乙醇中。 在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 在 35mm 培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep™ Mouse 1× 淋巴细胞分离液 （取用前恢复至室温并摇匀） 。研磨（研磨操作请参考图二） 。 4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中， 覆盖 200-500 uL 的 1640 培养基（保持液面分界明显） 。 5. 室温，800g 离心 30min。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档， 设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6. 吸出淋巴细胞层，再加入 10mL 1640 培养基，颠倒洗涤。室温，250g 离心 10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。
48 T 96 T 5×96T 48 T 96 T 5×96T 48T 96T 48号 EZ-SepTM 名 称 规 格
DKW33-H1024
Human Lymphocyte Separation Tube 易得人淋巴细胞分离管
24 支/包
DKW33-R0100
EZ-SepTM Mouse 1× Lymphocyte Separation Medium 易得小鼠淋巴细胞分离液
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分离液等体积稀释并混匀后，再进行第 4 步操作。 � � 分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。 大鼠脾脏淋巴细胞分离操作： 因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离操作完 全相同。 � 大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作： 1. 2. 新鲜抽取的大鼠/兔子抗凝外周血 2-4mL 用 1640 稀释一倍 （血液稀释后分离效果更佳， 注意无菌操作）。 在 15mL 离心管中加入 3mL 淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面上 层，避免两种液体界面混合。 3. 4. 室温，800g 离心 15~20min。设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，设为第三档） 。 后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。
100mL 100mL 250mL
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其中 r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离（如下图所 示） ，单位为 cm。由于离心管的位置由转子（rotor）决定，因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。 附：快速换算表
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9.
丁 隆,等.[J]第三军医大学学报,2007,29(11):1072-1075
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注意： � 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠
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小鼠淋巴细胞分离液说明书
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本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为 Iodixanol，分 子量为 1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰 任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 EZ-Sep™ Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴 细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达 1 小时，离心分离后，淋巴细胞的 数量和质量没有明显变化，随后的 ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。
产品信息：
商 品 名：EZ-Sep™ Mouse 1×（英文） 易得小鼠淋巴细胞分离液（中文） 规 密 格：100mL/瓶 度：1.0810±0.0005g/mL (20 ºC) 内 毒 素：≤0.5EU/mL 适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 分离大鼠/兔子血液中的 PBMC 保存方法：4 ºC 避光保存，保持无菌 保 质 期：12 个月
特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法：
� � � 推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。 推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。 关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力 度。将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。 注意： 1. 控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直 接研磨而造成大批细胞死亡。
100mL
3. 淋巴细胞冻存液
货 号 名 称 规 格
UH-M1002-050
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50mL
4. ELISPOT 无血清培养基
货 号 名 称 规 格
DKW34-P0100 DKW34-R0100 UH-M1005-025
Lympho-SpotTM serum free medium primate Lympho-SpotTM serum free medium rodent Lympho-SpotTM serum free medium universal