毛细管电泳在生命科学研究中的应用

毛细管电泳（ＣＥ）技术是一种基于“以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品间不同组分在溶液中电泳迁移速度不同”的原理，利用电解槽和与之相连的毛细管对样品组成进行分离和检测的化学分析技术。１９３７年，诺贝尔奖获得者瑞士化学家Ａｒｎｅ　Ｔｉｓｅｌｉｕｓ教授利用电泳现象发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，从而开创了电泳技术的新纪元。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，在生物化学实验技术中占据了重要地位。美国加州大学伯克利分校的ＲｉｃｈａｒｄＭａｔｈｉｅｓ教授更于２０世纪９０年代开始发展芯片电泳方法，发展出了世界上独具特色的碟形高密度集成毛细管电泳芯片，大大提高ＤＮＡ分子的测序速度。

电泳是指介电子中带电粒子在电场的作用下，以不同速度向电荷反方向迁移的现象，利用这一现象对生物化学组成进行分离分析的技术就称之为电泳技术。毛细管电泳指在极细的毛细管内实现的一种非常重要的分离技术，已对生命科学的各领域发展起到了极其重要的作用。林炳承［１］论述了９６根阵列毛细管电泳的使用，大大加快了人类基因工程的研究进程。今后将以高通量、微通道电泳为主体，分离技术的微全分析系统将成为现代分析技术的主流。

有文献报道，循环血中存在有游离ＤＮＡ，但其来源尚不清楚。而目前循环血中的ＤＮＡ测定是采用试剂盒提取ＤＮＡ后，再用荧光方法进行定量，该法灵敏度低，选择性差。为此，张鹏等［２］提出一种毛细管电泳循环血ＤＮＡ的定量方法，将血清样品经蛋白酶消化处理后，就可直接进入毛细管进行电泳分离，由于ＤＮＡ的电荷密度是比较均匀的，不同长度的ＤＮＡ片段具有相同的淌度，故将会在相同时间出峰，即可得到ＤＮＡ的总量。如果在毛细管内填充筛分介质，可以对循环血ＤＮＡ的片断进行分离检测。所以，作者认为毛细管电泳是测定循环血ＤＮＡ的有效方法。

对于复杂的蛋白质样品，一维毛细管电泳由于电压和分离柱长的原因，限制了其实际柱效和峰容量。而多维分离技术因其潜在高峰容量，在复杂样品分离分析中倍受关注。对于细胞或组织的全蛋白分析，传统二维凝胶电泳（２－ＤＰＡＧＥ）已成为常规分离分析方法。相比之下，传统平板凝胶电泳多为手工操作，费时费力。随着后基因组时代来临，迫切需要开发高通量、高分辨率、高效的分离分析。刘和春等［３］设计并制作了一种新型中空纤维接口，以此为核心构建了毛细管等电聚焦（ＣＩＥＦ）　／毛细管无焦胶筛分（ＣＮＧＥ）电泳二维蛋白分离技术平台，实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中，用此装置对血红蛋白样品进行了高效、快速的分离分析，实践证明此方法比一维分离系统有较大的提高。

近年来，已经发现在人和动物体内存在一些痕量Ｄ－氨基酸，并以证明是在细胞中生物合成。生物体内的Ｄ－氨基酸具有某种重要的生理功能，氨基酸的手性拆分和检测在生命的起源和发育、病变和衰老等研究中具有重要意义。由于毛细管电泳手性拆分具有高效、快速、低耗等优点，同时分离所需样品量少（ｎＬ级），特别适合于质量有限的生物样品的分离和测定。赵树林等［４］以Ｃｕ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ－Ｃｕ－Ａｓｐａｒｔａｍｅ三元配合物为手性选择剂，对５种含有芳环结构的天然氨基酸对映体，进行了手性拆分研究，结果令人满意。

周平［５］等用毛细管电泳分离ＤＮＡ片段，主要以非交联线高分子作为筛分介质，常用的筛分介质有线性聚丙烯酰胺纤维素衍生物、聚乙二醇、聚环氧乙烷等，其中以线性聚丙烯酰胺应用最为广泛，能区分相差一个碱基的核苷酸。但是，线性聚丙烯酰胺有粘度大，碱性条件下不稳定等缺点，我们采用一些Ｎ－取代丙烯酰胺作为筛分介质，以聚Ｎ－　异丙基丙烯酰胺及甘露醇组成无胶筛分介质，对ф×１７４／ＨａｅⅢＤＮＡ片段进行了分离研究。

刘和春等［６］介绍了一种在毛细管柱上原位腐蚀而成

毛细管电泳在生命科学研究中的应用（１）

李玉珍１，尹 洧２

（１．　北京海淀区学院南路７６号１４信箱，北京 １０００８１；２．　北京市化工工业研究院，北京　１０００２２）

摘要 毛细管电泳是一个重要的分析方法，在生命科学研究中具有重要的作用。本文对毛细管电泳的现状和进展进行

了综述，并收集了３４篇近期这方面的资料。

关键词 毛细管电泳，生命科学

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的多孔膜接口的制作方法，并用该接口构建了一类毛细管电泳二维分离技术平台。柱上原位腐蚀刻成的多孔膜接口具有零死体积、成本低廉、耐用、柱间切换便捷等优点，特别适合作为基于毛细管柱的二维及多维电泳联用中的接口，是目前二维及多维毛细管柱联用中一类较为新型、实用、理想的接口。以鹿茸冻干粉可溶样品为例，验证了该接口在二维毛细管电泳联用系统中的可行性和分离效能。实验结果表明，鹿茸冻干粉可溶样品整个二维分离分析的时间在１ｈ内即可完成，二维分离系统的分辨率和总峰容量都比一维的要高。

刘春叶等［７］介绍了毛细管电泳柱和微流芯片通道的涂层材料和涂层技术的进展情况，涂层对分离效果和分离结果重现性的影响。将涂层材料按照动态和静态分类，静态涂层又分别按照均聚物、共聚物、杂环类等进行了讨论。还对交联反应法、溶胶－凝胶法、辐照法、化学沉积法等涂层制备方法作了介绍。这对毛细管电泳柱和微流芯片通道的改良具有一定的参考价值。

糖类是继ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质之后生命科学领域中又一前沿研究课题。毛细管电泳这一新型分离技术令人瞩目。熊少祥等［８］利用激光诱导荧光（ＬＩＦ）这种高灵敏检测器和增强型电荷耦合粘合附件（ＩＣＣＤ）用于毛细管电泳上，测定以氨基葡萄糖（ＧｌｃＮ）、氨基半乳糖（ＧａｌＮ）及氨基葡萄糖酸（ＧｌｃＮＯＨ）为模型的化合物。采用异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）作为荧光衍生试剂，由于吡啶对反应体系有催化和稳定产物的双重作用，故实验中采用含０．５％吡啶的ＦＩＴＣ丙酮溶液。为满足毛细管电泳分离的要求，选择硼酸盐溶液作为衍生缓冲溶液，其浓度为４ｍｍｏｌ／Ｌ。考察不同ｐＨ值的缓冲溶液对衍生效率的影响，衍生反应宜在碱性条件下进行，故ｐＨ选择在９．２，当ＦＩＴＣ浓度为糖浓度的２５倍时，衍生效率达到最大，随后趋于稳定。但当加入ＦＩＴＣ过多时，会导致电泳分离时试剂峰过大，不利于被测物的电泳分离，故选用ＦＩＴＣ的量为糖量的３０倍左右为宜。对ＣＥ条件的优化，选用硼酸盐作为缓冲溶液，浓度以２０　ｍｍｏｌ／Ｌ为宜，缓冲液的ｐＨ值对衍生物和电泳分离都有影响，综合考虑选择ｐＨ为１０．４，电泳电压为２０ｋＶ，ＩＣＣＤ选用曝光时间为０．１ｓ，荧光峰强度最大处１０×３０象素中电荷加和Ｂｉｎｎｉｎｇ输出，可得到较好的结果。ＣＥ分离的效果：ＧｌｃＮ的检测限为８．５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ，质量检测限为１７０　ｍｍｏｌ／Ｌ；ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ和ＧｌｃＮＯＨ电泳分离的理论塔板数分别为：２．４×１０５、１．９×１０５及１．２×１０５，组成相同的ＧｌｃＮ和ＧａｌＮ　之间达到基线分离。

生物分子间的相互作用广泛存在，研究大分子和小

分子之间的相互作用的方法有平衡透析法、ＨＰＬＣ法、亲和毛细管电泳法等。亲和毛细管电泳法测定的样品量小，可在生理条件下测定，适于研究生物分子间的相互作用，测定亲和常数和研究亲和作用。但由于蛋白质在管壁的吸附作用，必需添加改性剂对毛细管壁进行修饰，但更方便的方法是限制蛋白质进入毛细管内。Ｂｕｓｃｈｅｒ等曾在区带毛细管电泳中通过微透析膜向毛细管引入样品，该系统是由电透析装置以及毛细管电泳仪两个部分组成，适合于带正电荷物质的进样。方梅等［９］提出一种在线微透析三电极毛细管电泳的新方法适用于定量研究生物大分子与小分子之间的相互亲和作用，用于带正、负电荷或不带电荷物质的进样。方法具有简便易行、样品用量少、测定速度快等特点，并能在生理环境下测定。使用ＬＣ９０型ＵＶ检测器，石英毛细管内径为５０μｍ，截止分子量为１．８万的微透析膜，磷酸缓冲液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　７．４），检测波长２４５ｎｍ。实验考察了进样电压对进样量的影响，当进样电压增高时，进样量线性增加，其相关系数为０．９９２２，但考虑到随电压的增高产生的热效应对寿命可能有影响，故进样电压选择在４ｋＶ，进样精度用１６μｍｏｌ／Ｌ的磺酸甲基异口恶唑（ＳＭＺ）标液，测定方法的精密度，峰面积的ＲＳＤ为２．６％。在低浓度范围内，ＳＭＺ的电泳峰面积与浓度呈线性关系，其相关系数为０．９９２９。实验测定了ＳＭＺ与牛血清蛋白（ＢＳＡ）亲和常数。本方法由于微透析膜与毛细管电泳的在线组合消除了大分子对游离小分子浓度的干扰，同时还测定了ＢＳＡ与Ｌ－色氨酸的亲和常数。

电渗是毛细管电泳的基本现象之一，可控制组分的迁移速度和方向，进而影响毛细管电泳的分离模式、分离进程和分离重现性等。朱英等［１０］提出了一种可利用径向电场控制电渗的新型毛细管电泳装置。此系统采用单一高压电源，成本低，可同时实现电泳操作和电渗控制。新设计的毛细管电泳装置有以下特点：１）分离系统独立于进样和检测系统，且采用密封结构，可隔离电场对其它单元的不利影响，便于仪器化；２）通过极性转换开关和可变电阻，容易实现不同模式的电场控制，成本低廉；３）实验电渗速度用中性标记物法测定，标记物经扩散或迁移引入毛细管的正极或负极端，分离后在２０６ｎｍ处检出，当ｎ＝３时，其ＲＳＤ小于５％；４）分离通道使用弹性石英毛细管，解决了分离管易损坏的问题；５）新系统的电渗控制能力与国外复杂系统效果相近，在ｐＨ＜６．０条件下，径向电场对电渗有调节作用，调节能力随ｐＨ值的下降而升高。本系统的应用正在研究之中，作者认为由于新系统有如上特点，故具较大优越性。

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