文献综述-蛋白含量测定方法

文献综述

蛋白质含量的测定方法

摘要食品中蛋白质是人体中最重要的营养要素之一，测定蛋白质的含量是食品检验工作中很重要的一项内容。本文主要对现阶段食品中蛋白质含量测定的常用方法进行探讨，介绍这些方法的原理、实验步骤、特点及应用等方面的内容。关键词：蛋白质含量测定方法原理特点应用

1 蛋白含量的测定方法

1.1 凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定蛋白质的经典方法，也是我国规定的测定食品中蛋白质含量的标准方法。

1.1.1 实验原理

蛋白质是含氮的有机化合物。含蛋白质样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后取消化液碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，计算出蛋白质含量。计算公式如下，

含氮量×6.25=蛋白含量

1.1.3 特点

凯氏定氮法是测定蛋白含量的经典方法，其测定结果比较准确，该法灵敏度高，最低可检出0.05mg氮，且样品用量少；精密度、准确度高，平行误差一般小于0.5%；应用范围广，应用于一切形态的食品与生物样品，尤其对于不溶和浑浊的样品，凯氏法也可以测定。但测定需要经过消化、蒸馏、吸收、滴定等步骤，手续繁琐，耗费时间长。并且凯氏定氮法实际上测定的不是蛋白质的含量，是通过测定氮含量来推算蛋白质的含量，因此测得的是粗蛋白，不能够区分蛋白氮和非蛋白氮。

1.1.4 应用

韩博[1]等人运用凯氏法测定了大豆中粗蛋白的含量，实验采自中国不同地区的162种大豆样品作为试验材料，分别采用了凯氏法和杜马斯燃烧法测定其粗蛋白含量，分析了两种方法的差异，以确定一种快速安全的测定饲料原料粗蛋白含量的方法。结果表明，二者差异不大，在本实验中所选定的样品范围内，两种方法可以互相代替。

鲁健章[2]等人运用凯氏定氮法测定了鱼类中蛋白质含量，并分析了该法测不准蛋白含量的原因并探讨了改进措施。在此试验中，共统计了30种不同种属的鱼类（海水鱼类和淡水鱼类）的非氨基酸态氮的含量，发现不同种属间非氨基酸态氮的含量差异很大（2%-30%），及时是同一种属的鱼类，其非氨基酸态氮含量差异也很大（变异系数多为50%左右）。故探讨了该法的改进措施，可采用挥发性盐基氮的测定方法（GB/T5009.44-2003）使用凯氏定氮装置在碱性溶液中将非氨基酸态氮蒸馏出来，以硼酸溶液回收。回收的非氨基酸态氮含量采用凯氏定氮法测定，计算非氨基酸态的质量分数。

王宗乾[3]等人运用凯氏定氮法分析牛奶蛋白纤维中的氮含量。尝试以含氮量变化来表征因染整加工而引起的纤维中蛋白组分的变化，并通过正交试验优化了凯氏定氮的消化工艺。

1.2 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

1.2.1 实验原理

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究[4]发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 标准曲线的绘制

取7支试管，按下表平行操作。

试管编号0123456

标准蛋白溶

00.010.020.030.040.050.06

液（mL）

0.15mol/L

0.10.090.080.070.060.050.04

NaCl（mL）

考马斯亮蓝

5mL

试剂（mL）

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm

绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品蛋白浓度的测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

1.2.3 特点

蛋白质分子都具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺基团结合，使溶液变为蓝色，而且这种蓝色溶液相对很稳定，在1h内吸光度值变化很小，且与传统分析方法相比，该方法操作简便、经济且结果较为准确尤其适合测定低浓度的蛋白质样品。该法灵敏度高、重现性好，是测定乳品蛋白质的有效方法。

1.2.4 应用

孙士青[5]等人采用考马斯亮蓝G-250染料染色法对市售乳品中蛋白质进行测定，结果表明，供试乳品溶液中蛋白质含量在10-80μg/ml范围内时，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量效果比较好。

董娜[6]等人采用考马斯亮蓝法测定奶粉中真蛋白的含量，实验结果表明，考马斯亮蓝法可排除添加非蛋白含氮物对奶粉真蛋白含量测定的影响，可以快速、

准确的测定奶粉真蛋白含量。

杨正坤[7]等人采用考马斯亮染色法测定大豆茎叶中蛋白质含量，结果表明该法是可行的。测得大豆茎叶蛋白质平均含量在7.673%和11.315%，相比其他传统方法，具有更大的优势。

董文茜[8]等人采用双缩脲法和考马斯亮蓝法对蛇毒蛋白含量进行了测定。试验以蝰蛇毒为载体，结果表明，双缩脲法测得的蝰蛇毒蛋白含量范围在19.49%-25.69%，而考马斯亮蓝法测得的蛋白含量范围在79.53%左右，明显后者比前者更有优势。

1.3 双缩脲方法

1.3.1 实验原理

双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，蛋白质的浓度越高，体系颜色越深，据此可用吸收光度法测蛋白质含量。蛋白质中的肽键与碱及少量硫酸铜溶液作用生成的紫红色配合物，在560nm处具有最大吸收波长。将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白溶液同事与双缩脲实际反应，并于560nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品蛋白质的浓度。

1.3.3 特点

本法操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，可快速测定蛋白质的含量。该方法测定范围为1-20mg蛋白质，灵敏度低，一般适用于需要快速，但精确度要求不高的蛋白质含量的测定。

1.3.4 应用

张丽娟[9]等人运用双缩脲法检测了大豆分离蛋白中蛋白质含量。结果表明，当大豆蛋白质含量在0-120mg的范围内，线性关系比较好，吸光度值为0-0.596变异系数小，重现性高。

由于该法只适合于那些对精度要求不高的蛋白质含量的测定，故其局限性