目的基因导入受体细胞

三、动物受体细胞：
– 优点：
能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA 。
真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好 的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。
易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。
经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工 ，成本低。
枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。
枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。
枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控 、分子遗传学背景清楚等优点。
• 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病单链DNA转化因子的整合。整合复合物前体中
的单链DNA片段可以通过同源重组，置换受体细 胞染色体DNA的同源区域．形成异源杂合双链 DNA结构。
• ⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂 合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后， 该染色体发生分离，形成一个新的转化子。
• 大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很 难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较 为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体 菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质 粒DNA分子，而非来自供体菌的游离DNA片段(转 化因子)。
• 研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式 导致50％~70％细菌死亡时，转化水平达到最高 。
• 用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞 的制备容易得多．当细菌生长到对数中期后予 以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降 低细胞悬浮液的离子强度，并用10％甘油重悬 细胞，使其细胞浓度为3×l010个／m1。分装， 在干冰上速冻后置于－70℃贮存。这样，每小 份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以 上。
• 电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效 率要比在室温下操作提高约100倍。
（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌
• 简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的 迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些 难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌 。
• 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所 须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞 间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶 合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒 通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的 非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。
• 转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化 子的出现，因此须设以下几种对照处理：
DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感 受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。
感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液 代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。
感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入 0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。
和加工。
二、植物受体细胞
– 优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的 培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着 一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定 遗传的植株或品系。
– 缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞 壁，不利于摄取重组DNA分子。
– 现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉 米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式 植物。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的 羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上 。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶 结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子 提供了进入细胞的通道。
• 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制 备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化， 每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵 落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。
– 缺点：组织培养技术要求高，难度较大。
– 目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、 猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或 动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。
– 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优 点。
• 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感， 通常很少采用。
DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制
• 一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能 转化，而线形DNA分子不能获得转化子。因此，环 状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA分 子的转化效率。
• 也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA， 但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转 化过程相似。
• ②转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的 DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构 持异性结合，然后激活邻近的核酸酶，将 双链DNA分子中的一条链逐步降解，同时 将另一条链逐步转移到受体菌内。
• ③整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单 链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合 复合物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种 胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色 体DNA处。
• Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用 Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高 DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二 硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频 感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000 倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。
原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物 不稳定。
• 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌 、枯草杆菌、蓝细菌等。
一、大肠杆菌受体细胞
• 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得 最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一， 也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟 的载体受体系统。
• 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。
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4.1 受体细胞
• 受体细胞(receptor cell)
– 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从 实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定 维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值 和理论研究价值的细胞。
– 作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性： 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；
以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可 能机制包括如下基本步骤：
• ①细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细 胞时．受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋 白，又称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分 溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核 酸酶等，此时细菌细胞处于感受态，极易接纳 周围环境中转化因子以实现转化。
基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体 基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。
• 缺点：
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统， 即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空 间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多 真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化 或磷酸化等修饰作用。
• 因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然 转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方 法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中 代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法 。
（1） Ca2+诱导的大肠杆菌转化法
• Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：
①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时 Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与 内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形 成感受态。
4.2 重组DNA分子转入原核生物细胞
• 4.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
– 转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进 入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达 的过程称之为转化。
– 转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球 菌中发现的。
目录
• 细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供 体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在 细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基 因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状 的过程。
– 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA 和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。
– 细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。
– 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水 和适宜的温度就能满足生长需要。
– 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件 。
• 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶 绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统 Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征 ，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一 种典型的原核生物。
• 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优 点，具体表现在：
– 真菌细胞 – 植物细胞 – 昆虫细胞 – 动物细胞
原核生物细胞
• 优点：
大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便 于外源DNA的进入。
没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为 外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。
原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材 料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实 验快。
– 酵母菌细胞
• 是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。 • 优点：
酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控 机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。