第6章 发酵产物的提取与分离

②非机械法： 酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁成分 的特殊化学键，达到使细胞破碎的目的。 分为外加酶法和自溶法（常采用加热或干 燥法）。 渗透压冲击法是将细胞先放入高渗透压的 介质中，在达到平衡后，介质被突然稀释， 或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速 进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁 的破裂。
⑤反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm~1nm)， 对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜， 截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗 透也是以压力差为推动力，操作压达 3MPa~10 MPa。 ⑥纳米过滤：以压力是为推动力，用纳米 过滤膜(孔径约2nm)，从溶液中分离出相对 分子质量300~1000的物质的膜分离过程。 特点是：在过滤分离过程中，能截留小分 子有机物，同时透析出盐，达到浓缩和透 析目的；操作压力低，节约动力。
细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法； 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
①机械法： 高压匀浆法是利用高压使细胞悬液通过针 型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环， 造成细胞破碎；X-press法或Hughes press法是一种改进的高压法，其操作方法 是将浓缩的菌体悬浮液冷冻至-25℃~-30℃ 形成冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击， 将冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于冰 晶体的磨损，造成包埋在冰晶体中的微生 物变形而引起细胞破碎。 此方法适用范围广，破碎率高，细胞碎片 的粉碎程度低，活性保留率高。但是不能 用于对冷冻融解敏感的生物物质。
等 电 点 锌 盐 法
钙 盐 法 提 取 谷 氨 酸 工 艺 流 程
（4）有机溶剂沉淀法：许多有机溶剂如丙 酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生 物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大 分子发生沉淀作用。 这种沉淀作用主要是由于水溶液介电常数 降低、静电引力增大，带电溶质互相吸引 凝集。 具有水化层的生物分子，有机溶剂与水的 作用，使得这些分子脱水而相互聚集析出。
③微滤：微孔过滤，利用孔径 0.025μm~14μm的多孔膜，过滤含有微粒 的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、 分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通 常为0.1MPa~0.5MPa。 ④超滤：滤膜孔径为lnm~20 nm，用于过 滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为 推动力，通常为0.1MPa~0.6MPa。
盐析法：在蛋白质溶液中加入一定量的中 性盐后，盐离子在水中发生水化，使蛋白 质脱去水化膜层，暴露出琉水区域，疏水 区域相互作用使蛋白质沉淀；同时中性盐 的解离，中和蛋白质所带电荷，使蛋白质 分子间排斥作用减弱而相互聚集。 中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化 钠等，生产上常用硫酸铵。 其优点是成本低、操作简单、安全和对许 多生物活性物质具有稳定作用。
反复冻融法是将细胞反复在低温下突然冷 冻后在室温下融化，最后引起细胞破碎。 低温冷冻使细胞膜的疏水键结构断裂，增 加细胞亲水性能；同时胞内水结晶使细胞 内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨 胀而破裂。 可采用此法处理细胞壁较脆弱的菌体，但 通常破碎率较低，有时即使反复如此处理 仍不能提高破碎率。 此外还可能引起对冻融敏感的蛋白质变性。
①调pH：除去蛋白质等两性物质，改变易 吸附分子的电荷性质，减少滤膜堵塞和污染。 ②凝聚与絮凝：形成较大絮团，减少堵塞。 ③吸附剂法：将细菌吸附在吸附剂上，形成 较大的颗粒，减少堵塞。 ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。 ⑤反应剂法：
3．细胞破碎与分离
有机溶剂沉淀法的优点是分辨能力比盐析 法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶 剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂 密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固 液分离；而且有机溶剂容易蒸发，不会在 成品中残留，因此适用于食品、药品的制 备。 其缺点是容易引起蛋白质变性失活，并且 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
（1）高价无机离子的去除：发酵液中主要 的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+等。 钙离子常使用草酸（草酸钠）去除。 Mg2+可加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形成可 溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 F3+离用黄血盐反应生成普鲁士监沉淀除去。
（2）杂蛋白的去除：
①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。 ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。 ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
干燥法可采用空气于燥、真空干燥、喷雾 干燥和冷冻干燥等。 干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙 酮、丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就 容易被抽提出来。
（3）细胞碎片的分离：常用离心分离法。 近年来利用双水相萃取法，使生物大分子 或细胞碎片在两相或多相中进行不同的分 配，达到分离的目的。 另外，向细胞碎片悬浊液中加入某种固体 吸附剂，或使悬浮液通过装有吸附剂的固 定床，也可达到去除细胞碎片的目的。
（3）色素及其他物质的去除 常用的脱色方法有离子交换剂、离子交换 纤维、活性炭等材料吸附。
2．离心过滤与菌体分离
菌体分离通常采用离心分离和过滤两种方 法。 离心分离是在离心力场的作用下，将悬浮 液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒 较小的悬俘液和乳浊液的分离。 离心方法有差级离心法、密度梯度离心、 等密度离心、平衡等密度离心。 细菌和酵母菌发酵液多采用离心分离。 霉菌和放线菌多采用过滤分离。
6.2 发酵液的预处理及菌体分离
发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第 一步操作。 目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶 性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利 于提取和精制工序的操作。 预处理中常用酸化、加热、加絮凝剂、过 滤、离心等方法。
1．发酵液的预处理
杂质直接影响产品质量和收得率，对提取 和精制也有很大影响，特别是高价无机离 子和杂蛋白等。 高价无机离子会影响树脂对生化物质的交 换容量。 杂蛋白降低树脂的交换容量和吸附能力， 溶剂萃取时引起乳化，堵塞过滤介质，或 使滤膜受到污染。
（1）等电点沉淀法：利用两性电解质在电中 性时溶解度最低的原理进行分离纯化。在低 离子强度下，调节至等电点，可使各种两性 电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解 度。 不同的两性电解质具有不同的等电点，从而 将其分离开。 等电点沉淀法优点是许多蛋白质的等电点都 在偏酸性的范围内，而许多无机酸价格低廉， 并能为食品标准允许，因此常可无须除掉残 余的酸，而直接进行下一步纯化操作。 其主要的缺点是酸化时，容易引起蛋白质失 活。不少蛋白质与金属结合后等电点会发生 偏移。
2．提取和精制
提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。 但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处 理和菌体分离、提取、精制、成品加工。
发酵产品后处理过程流程图
发酵液预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝 等技术，加速固液分离，提高过滤速度。如 果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分 离细胞碎片。 初次纯化即提取，主要是除去与目标产物性 质有很大差异的物质，浓缩产物，提高产品 质量。常用方法有沉淀、吸附、萃取等。 高度纯化即精制，采用对产品有高度选样性 的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂 质。典型的方法有层析、离子交换等。 成品加工是为了获得质量合格的产品，常用 浓缩、结晶、干燥等技术方法。
（6）非离子型多聚物沉淀：可用于选择性 沉淀从而纯化蛋白质，应用最多的是聚乙 二醇(PEG)。 作用机制有几种假设：多聚物与有机溶剂 相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大 分子形成复合物，发生共沉淀作用等。 非离子型多聚物沉淀法操作条件温和，不 易引起生物大分子变性，沉淀效果好，沉 淀后的多聚物容易除去，广泛应用于核酸、 蛋白质、细菌和病毒等的分离纯化。
（2）离子交换膜电渗析法：是利用可解离基 团，在外加电场作用下，经有选择透过性的 高分子膜，使各种带电性物质分离的技术。 膜的种类很多，根据结构可分为非均相、半 均相和均相离子交换膜；按作用可分为阳离 子交换膜、阴离子交换膜和具有特种性能的 离子交换膜；根据应用可分为电渗透浓缩用 膜、电渗透脱盐用膜、电解隔膜、对特定离 子具有选择透过性的离子交换膜、扩散渗透 用离子交换膜、反渗透用离子交换膜。 利用离子交换膜的选择透过性，进行抗生素、 柠檬酸和氨基酸等产物的提纯。
过滤的原理是悬浮液通过过滤介质时，固态 颗粒与溶液分离。 根据机理，过滤可分为澄清过滤和滤饼过滤。 澄清过滤中，过滤介质为硅藻土、砂、颗粒 活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
6.3 发酵产物的提取和精制
1．沉淀法是通过改变条件或加入某种试剂， 使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而 沉降析出的过程。 沉淀法浓缩作用大于纯化作用，是初步分 离的一种手段。 沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、 收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点， 不足之处在于过滤困难、产品质量较低、 需要重新精制。
超声波法是利用超声波的空穴作用使细胞 破碎，由于这种空穴泡又受到超声波的迅 速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介 质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使 细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。 超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，所 以操作时可以在细胞悬浮液中投入冰块或 在夹层中通人冷却水进行冷却。
（1）影响发酵液过滤的因素
发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。