细胞融合的原理与技术 (2)
细胞融合实验报告
一．实验目的1.了解并掌握细胞融合的方法2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用二．实验原理两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
主要过程包括：1.制备原生质体：微生物及植物细胞有坚硬的细胞壁，需要用酶将其降解，而动物细胞无需要去壁处理。
2.诱导细胞融合：两种亲本细胞的悬浮液调到一定密度，滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用物理方法如电刺激促进融合。
3.筛选杂合细胞：在特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地生长，除去其他未融合的细胞。
细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
三．实验结果与分析讨论融合细胞的观察实验中发现大部分的融合都是3个细胞的融合，两个相互融合的很少基本没有找到。
细胞融合实验报告讨论
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，探讨细胞融合的基本原理、方法及其应用。
通过实验，观察细胞融合过程中细胞的行为与变化，了解不同细胞类型融合的差异，以及细胞融合在生物技术领域的应用前景。
二、实验原理细胞融合是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象。
细胞融合技术在生物技术、医学、生物工程等领域具有广泛的应用前景。
本实验采用聚乙二醇（PEG）作为细胞融合的诱导剂，通过改变细胞膜的通透性，使细胞发生融合。
三、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等。
（2）试剂：聚乙二醇（PEG）、Hanks液、生理盐水、双蒸水等。
（3）器材：显微镜、离心机、水浴箱、离心管、滴管、载玻片、盖玻片等。
2. 实验方法（1）细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等细胞分别培养于DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中。
（2）细胞融合：将细胞以1×10^6个/mL的浓度接种于培养皿中，待细胞生长至约70%融合时，加入一定浓度的PEG溶液，使细胞发生融合。
（3）观察与检测：通过显微镜观察细胞融合情况，采用流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量，分析细胞融合的效果。
四、实验结果1. 显微镜观察在显微镜下，观察到细胞融合现象明显，部分细胞出现双核或多核现象。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪检测结果显示，融合细胞的DNA含量与正常细胞相似，说明细胞融合成功。
五、讨论1. 细胞融合的基本原理细胞融合是细胞生物学领域的一个重要研究方向。
细胞融合的基本原理是：通过改变细胞膜的通透性，使细胞发生质膜融合，进而实现细胞内容物的相互交换。
本实验采用PEG作为细胞融合的诱导剂，其作用机理是改变细胞膜的通透性，使细胞内物质外泄，进而促进细胞融合。
2. 不同细胞类型融合的差异本实验观察到小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等细胞均能发生融合。
细胞生物学实验-细胞融合
细胞融合应用
一. 单克隆抗体 1975年英国科学家 Milstein和Kohler将产生抗体 的淋巴细胞 同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理 学奖。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 "for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies"
2化学法（聚乙二醇）
PEG: 聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG） 分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH 性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、
沉淀蛋白质的作用 分子量 〉1000-6000u，可作诱融剂。
20世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合
显微镜下的细胞融合过程
细胞融合的过程
细胞互相靠近 细胞膜融合 细胞桥形成 细胞质融合 细胞核融合
细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互 相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核 融合主要步骤。
细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步， 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂 形成细胞桥。
细胞融合过程中两个细胞膜的变化
• 来源
前处理
融合的方法 主要应用
• 动物细胞 不需
仙台病毒,
PEG ，电融合 生产单克隆抗体
• 植物细胞 脱壁 PEG,电融合 创造植物新品种
• 微生物细胞 脱壁 PEG,
高产优质新菌种
加入融合剂
未融合
未融合
融合细胞的类型
同核体
同核体
异核体（杂交细胞）
• 同核体：由同一亲本细胞融合而来
简述细胞融合的三种方法及其原理。
简述细胞融合的三种方法及其原理。
细胞融合是生物学研究中常见的技术手段，可以让不同细胞相互融合，产生新的细胞体系。
细胞融合有多种方法，其中比较常见的有三种：电穿孔法、聚合物法和化学法。
1. 电穿孔法
电穿孔法是一种通过电场刺激细胞膜使其短暂性通道的技术。
一个电场被施加在一个包含两种细胞的混合物上，这些细胞处于暂时开放的状态，此时它们可以聚集成一个共同的体系。
这种方法在体外胚胎发生的研究中被广泛使用，因为能够将精子和卵子结合在一起，形成合子。
2. 聚合物法
聚合物法通常被称为聚乙二醇融合法（PEG），PEG是一种高分子聚合物，将两种互不相容的细胞暴露在其下时可以使其互相融合。
这种方法通常被用于融合细胞膜不容易被电穿孔的情况下，比如人肝癌分裂后的肿瘤细胞。
PEG被认为是缓慢地溶解了细胞膜的存在，从而带来了细胞体中的融合。
3. 化学法
化学法将细胞膜表面使用特殊化学物质覆盖，从而形成一个融合机制。
这些成分
通常是两性离子基，如溴化锭离子（BR）和醋酸骨架体离子（ABT）是最常用的。
一旦细胞表面被包裹了这些化合物，它们会被带入一个电场环境并自行结合。
这种方法被广泛用于体外或体内制备混合细胞吸入无数的空气泡中，以用于非侵入性的支气管病变治疗。
以上三种方法是常用的细胞融合技术，尤其在生物学研究中，根据需要的实验目的选择不同的方法来获得合适的融合细胞。
细胞融合实验报告
细胞融合实验报告细胞融合是一项重要的生物学实验，通过将两个或更多不同种类的细胞融合在一起，可以产生具有新特性和功能的细胞。
这项实验被广泛应用于生物技术领域，如基因工程和医药研究。
本篇文章将介绍细胞融合实验的原理、方法以及实验结果的分析。
1. 实验原理细胞融合实验的原理基于细胞膜的特性。
细胞膜是一个由脂质双层组成的结构，它具有选择性通透性，可以控制物质的进出。
当两个细胞膜相接触并施加足够的压力时，膜上的脂质双层可以融合在一起，形成一个新的融合细胞。
融合细胞中的细胞质和细胞核会混合在一起，进而导致基因和特性的交流和融合。
2. 实验步骤细胞融合实验通常包括以下几个步骤：(1) 细胞培养：融合实验需要选择要融合的细胞类型。
这些细胞可以来自同一物种，也可以来自不同物种。
首先，我们需要将这些细胞分别培养在适宜的培养基中，使它们保持健康和繁殖能力。
(2) 细胞收集：当培养细胞达到一定数量时，我们可以用细胞消化酶将其从培养器中收集出来。
这些细胞将会成为细胞融合实验的实验材料。
(3) 细胞融合：细胞融合可以通过化学物质或电脉冲等方式实现。
化学物质可以使细胞膜变得亲和，从而促进融合。
电脉冲则可以在短时间内破坏细胞膜，使融合发生。
在实验中，我们可以选择适合的方法进行细胞融合。
(4) 融合细胞培养：融合细胞在培养基中继续培养。
这个过程中，我们可以观察和记录细胞的生长和分化状况。
(5) 实验结果分析：通过观察和比较融合细胞与原始细胞的差异，我们可以得出实验结果和结论。
3. 实验结果与讨论在细胞融合实验中，我们可以观察到融合细胞和原始细胞在形态、功能和特性上是否有区别。
例如，当我们融合两种草莓品种的细胞时，发现融合细胞中既有母本细胞的特性，又有父本细胞的特性。
这表明细胞融合可以导致基因和特性的交流和融合，进而产生具有新特性的细胞。
细胞融合还可以应用于医药研究领域。
通过将人类细胞融合在小鼠胚胎细胞中，科学家们可以研究人类疾病的发生机制，寻找新的治疗方法。
细胞生物学实验手册：细胞融合实验原理及步骤
实验十一细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。
【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
细胞融合实验原理
融合过程
相关实验溶液的配制
Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g， NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。 GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4· 2H2O 1.77g，NaH2PO4· H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红 0.01g，溶于1000ml水中。 50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000） 放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至 50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混 匀，置37备用。
实验操作
5. 取以上细胞悬液0.2ml放入1ml的EP管中，然后放入 37℃水浴中预热，同时将50％PEG液一并预热20min； 6. 20min后将0.2ml的50％PEG溶液逐滴沿离心管壁加 入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃ 水浴中保温20min； 7. 20min后，加入GKN溶液1ml，静止于水浴中20min 左右； 8. 1500r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液再离心 1次； 9. 弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮于 载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀，3min 盖上盖玻片，观察细胞融合情况。
细 胞 融 合
实 验 原 理
两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细 胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台 病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多 病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而 就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离 子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。 PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细 胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形 成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用 高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及 单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合 技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
细胞融合技术的应用与原理
细胞融合技术的应用与原理1. 介绍细胞融合技术细胞融合技术是一种将两个或多个细胞融合在一起形成一个新的细胞的技术。
通过融合不同种类的细胞，可以实现细胞互补或新的细胞功能的产生。
细胞融合技术在生物医学领域有着广泛的应用。
2. 细胞融合技术的原理细胞融合技术的原理是通过人为干预，使得两个或多个细胞融合在一起形成一个新的细胞。
这种融合通常涉及到细胞膜的融合，使得两个细胞的质膜融为一体。
而细胞融合的方式可以通过物理或化学方法实现。
2.1 物理融合法物理融合法是指利用物理手段促进细胞融合的方法。
常用的物理方法包括电融合、超声波融合、机械压力融合等。
这些物理方法可以通过破坏细胞膜及间质酶的作用，促进细胞融合的发生。
2.2 化学融合法化学融合法是指利用化学物质促进细胞融合的方法。
化学方法主要包括聚乙二醇融合、高铵盐融合等。
这些化学物质在一定的条件下可以改变细胞质膜的性质，使得细胞融合变得可能。
3. 细胞融合技术的应用细胞融合技术在生物医学领域有着广泛的应用，下面列举了几个常见的应用领域。
3.1 疾病研究细胞融合技术可以用于研究疾病的发病机制。
通过将正常细胞与病变细胞融合，可以模拟疾病的发展过程，并进一步研究疾病的关键因素和治疗方法。
3.2 细胞重编程细胞融合技术可以用于细胞重编程的研究。
通过将干细胞与其他类型的细胞融合，可以转化这些非干细胞为干细胞，并进一步应用于组织工程和再生医学领域。
3.3 抗肿瘤研究细胞融合技术可以用于抗肿瘤研究。
通过将癌细胞与免疫细胞融合，可以增强免疫细胞的抗肿瘤能力，并提高治疗效果。
3.4 物种转化细胞融合技术可以用于物种转化的研究。
通过将不同物种的细胞融合，可以创造出新的物种，探索生物进化和物种间的关系。
4. 细胞融合技术的前景与挑战细胞融合技术在生物医学领域具有广阔的前景，但同时也面临一些挑战。
4.1 生物伦理问题细胞融合技术涉及到对细胞生物学的深入理解和应用，同时也牵涉到生物伦理的问题。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
(3) 细胞融合： 50%PEG(400~1000), pH8.0, 37oC, 2min
3.融合细胞的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
4.抗体的检测
常用方法：
要求： ➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
+3.6ml M
150ul/孔
E、F、 G、H
调细胞浓度为1-5х103cell/ml 取100个cell于7.2ml完全培养液 (M)中
2个cell/孔
1个cell/孔
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法
溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿 需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过 程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有 轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间 形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促 使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液
中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
【高中生物】动物细胞融合技术与单克隆抗体+课件+高二下学期生物人教版选择性必修3 - 副本
杂交瘤细胞(多种)
克隆化培养
第二次筛选 抗体检测 (抗原-抗体杂交技术)
阳性细胞
能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞
二 单克隆抗体及其应用
2、单克隆抗体的制备过程 能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞
体内或体外培养
注射到小鼠腹腔
体外培养 单克隆抗体
二 单克隆抗体及其应用
筛选原理：
①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。
张林琦教授团队
二 单克隆抗体及其应用
3、单克隆抗体的应用
3、运载药物 ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。阅读教材50页
思考：ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
二 单克隆抗体及其应用
3、单克隆抗体的应用
对点训练
下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （） A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性 B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
克服远缘杂交不亲和障碍
物理方法、化学方法、灭活病毒 形成杂种细胞
二 单克隆抗体及其应用
抗体
1.定义：机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发 生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
12）.抗每体个的B分淋布巴：细胞只分泌一种特异性的抗体
1）血清（主要） 22））体组内织产液生及的外特分异泌性液抗（体如种乳类汁多中达）百万种以上
二 单克隆抗体及其应用
2、单克隆抗体的制备过程 注射特定抗原
多种已免疫 B淋巴细胞
细胞融合的方法过程和影响因素
An Overview of membrane functions
1. Define the boundaries of the cell and its organelles.
1 PEG融合的关键是作用时间 provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion
动物细胞融合的筛选方式：
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对 药物敏感性差异筛选杂种细胞。
亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不 敏感
亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不 敏感
杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基 上生长
2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几 种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷 型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原 理可以筛选杂种细胞。
优点：
融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞
第二节 融合细胞的筛选
原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细 胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。
DNA合成途径有两种:
主要途径由氨基酸和其他小分子化 合物合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤 和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制 FH2活性，阻断FH2到FH4合成。
需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸） 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶: （催化次黄嘌呤产生肌苷）
亲本A：色氨酸缺陷型
细胞融合实验原理及步骤
实验十三细胞融合一、实验目的：两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代。
六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广，不仅名类细胞可以全并，种间远缘细胞也能合并，细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
动物细胞如此。
因此融合细胞的研究成为生物学不论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路，如目前在核质关系，体细胞的遗传与发育，新品种的培养，免疫作用，疾病的治疗和性状的改良。
潜伏病毒的研究等方面上，有的已取得了显著的成绩，有的正在探索之中。
通过实验对体细胞融合有一个清楚概念。
并初步掌握动物细胞合并技术。
二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤细胞。
用注射器剌入接种瘤细胞7—10天的小白鼠腹腔内吸取1或2ml腹水，注放离心管内；加改良的Hank’s液（pH7.4）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（转速）离心5分钟，取出上清液，再入改良Hank’s液，搅拌，再同样清洗两次，一次5分钟，一次十分钟，最后再加上适量Hank’s液。
计算每亳升的细胞数量，如与其它细胞合并用，适宜数目一般为107个/ml，即毫升约1000万个细胞。
（2）取鸡血球，在一只公鸡的翼静脉抽取，抽取数量随需要而定，如取5毫升，可用20毫升针筒，先将针与筒用Alsver液润湿，吸入50毫升Alsver 液剌入翼下静脉，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶内，使血液与Alsver 液的比例为1：4。
存入4℃冰箱内务作一星期使用。
作实验时取这种贮备的鸡血球1毫升加入4毫升0。
85%生理盐水以1200—1500rpm离心三次（5分钟、5分钟、10分钟），每次离心后去上清液，加0。
85%生理盐水并搅匀，最末一次离心后，根据沉淀血球量的多少，加入适量0。
85%生理盐水使成1%悬液（0。
1毫升血球加10毫升液体），取1%悬液1毫升加上2毫升或3毫升0。
85%生理盐水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500万左右。
细胞生物实验设计-细胞融合
一、实验目的1.了解聚乙二醇PEG诱导细胞融合的原理与技术2.学习并了解细胞融合技术二、实验原理细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。
细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新药，在动物方面主要用于产生单克隆抗体。
,诱导细胞融合的因素主要有三类：生物因数，物理因数，化学因素。
本实验主要应用化学因数PEG诱导细胞融合。
聚乙二醇PEG结构为HOH2C（CH2OCH2）n CH2OH，相对分子质量在200~6000。
PEG能够改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
三、实验材料与器械胃粘膜上皮细胞，脐血干细胞20ml离心管若干，试管若干，50%聚乙二醇，PKH26染料，RPIM1640完全培养基，/无血清培养基，完全培养基，低俗离心机，恒温水浴锅， 96孔板，荧光显微镜四、实验步骤（一）1.胃粘膜上皮细胞洗涤后去除消化酶，制备成单细胞悬液，在室温下进行试验:2.将处理后的细胞置于离心管中，添加适当无血清培养洗涤，400rpm离心5min3.去除上清液，残留液量<25ul，用1ml Diluent C重悬细胞4.将细胞悬液与1ml PKH26染料迅速混合5 .25℃培养2~5min，期间轻轻颠倒试管数次6.加入2ml兼容蛋白液（1% BSA）培养1min，终止染色^7.加入4ml完全培养基，25℃,400rpm 离心5min8.去除上清后将细胞移至新的离心管内再洗涤细胞三次9.用完全培养基洗涤细胞，离心后调节至所需细胞浓度10.按照实验步骤1~9方法处理脐血干细胞（二）-1.将处理后的胃粘膜上皮细胞和脐血干细胞溶液加入5ml PBS混合均匀，吹悬2.室温下400rpm离心5min，去掉大部分上清液，留下液体将沉降的细胞分散与其中，制成细胞悬液3.轻轻摇动试管，逐滴加入37℃下预热的50%聚乙二醇溶液4.将此悬液置于37℃水浴中培育15s，缓慢的加入无血清培养液5ml，终止PEG的作用5.缓慢倾斜离心管4~5次，以1500rpm离心5min，去除大部分上清液，留下液体悬浮细胞6.加入5ml RPIM1640完全培养基，混匀后加入96孔板中培养7. 12小时后倒置荧光显微镜下照相观察五、预计实验结果1.部分细胞发生融合。
细胞融合及其应用
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•电融合
原理：细胞处于不均一的交变电场，细胞极化
成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲 使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。 • 在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标 都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,
感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长
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2、营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营 养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂 种细胞。
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3. 细胞融合的类型
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1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣 告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部 分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出 马铃薯的块茎。
后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄 和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地 上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”， 据说番茄的产量很高。
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二、基本原理 ❖细胞融合的基本原理是什么？ ❖简述细胞融合的大致过程。
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1.相关概念：
合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞 的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的 细胞结构称为合胞体。
同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。
缺点: 仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易 失活，容易对细胞产生干扰；
细胞融合实验报告
实验报告实验名称：牛蛙血细胞的体外融合时间：20220418实验目的：1、掌握细胞融合的概念、类型和体外诱导细胞融合的方法。
2、掌握PEG诱导细胞融合的原理、影响因素和试剂作用，并掌握PEG诱导细胞融合的操作和注意事项。
3、掌握细胞计数板的使用和细胞计数的方法。
4、了解单克隆抗体制备技术。
实验原理：1、细胞融合：1）概念：细胞融合又称为细胞杂交，是通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程，或者用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞，此杂交细胞具有很强的生命力，增值网盛，并且细胞融合是形成杂交细胞的前提。
2）类型：分为自发融合和诱发融合。
自发融合是指同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并；诱发融合是指异种间的细胞必须经过诱导剂的处理才能融合。
3）方法：a.物理法：电、激光触合b.生物法：病毒诱导融合，如仙台病毒c.化学法：PEG诱导融合4）应用：制备单克隆抗体、疫苗生产、培育动植物新品种、获得优良的微生物菌种、膜蛋白研究等。
2、PEG（聚二乙醇）：(1)PEG是乙二醇的多聚化合物，具有强烈的吸水性，能使两个细胞接触点的距离拉近；能够凝聚和沉淀蛋白质，引起磷脂的酰键及极性基团发生结构重排，因此膜结构改变，引起细胞融合。
但是PEG长时间作用对细胞有毒性，因此作用一段时间后需要稀释或撤去。
(2)融合的活力与频率与PEG的相对分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
(3)PEG法最佳的融合条件：1）细胞：状态良好，得是单细胞悬液，有核细胞（便于观察，便于用光学显微镜判断是否成功融合）；因此选择新鲜制备的牛蛙血细胞，细胞很大且有核，若是培养的细胞，需要将其状态调至很好。
2）密度：5*105-106个/ml3）PEG：分子量4000，浓度为50%（浓稠的吸水性更好，但对细胞膜的损伤更大）4）温度：37℃5）缓冲液：pH7-84、细胞计数：1）细胞计数板：每个大方格的体积为0.1mm3，可换算为每毫升液体中的细胞数量。
细胞融合-方法-应用
• 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系 统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
6
第二节 细胞融合常用的方法
7
按促融剂的不同分为
• 生物法 • 化学法 • 物理法
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聚乙二醇（PEG）诱导法的步骤
1. 将两种不同亲本细胞各取5×l06个混匀； 2. 离心沉淀，吸去上清液； 3. 加1ml 50%PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； 4. 加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； 5. 加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加
培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养； 6. 6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
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• 细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技 术之一，已在农业、医药、环保等领域取 得了开创性的研究成果，而且应用领域不 断扩大。
• 细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、 遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因 定位、衰老控制等理论领域的研究提供了 有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、 遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗 体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分
程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
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电融合的基本步骤
• 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶 液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不 是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极 化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列 成串。
• 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频 直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个 紧密接触的细胞融合在一起。
细胞融合_实验报告
一、实验名称：细胞融合实验二、实验目的：1. 了解细胞融合的基本原理和过程。
2. 掌握聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的方法。
3. 观察细胞融合过程中细胞的行为与变化。
三、实验材料与用品：1. 细胞：小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞2. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰酶、50%聚乙二醇（PEG）溶液、无菌水3. 器材：显微镜、离心机、水浴箱、离心管、滴管、载玻片、盖玻片四、实验原理：细胞融合是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象。
细胞融合在生物体内和生物技术领域都有广泛的应用，如制备单克隆抗体、研究细胞信号传导等。
聚乙二醇（PEG）是一种常用的诱导剂，可以促进细胞融合。
五、实验步骤：1. 将小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别培养于DMEM培养基中，待细胞生长至80%融合时，收集细胞。
2. 将收集的细胞用0.25%胰酶消化，再用DMEM培养基清洗两次，制成细胞悬液。
3. 将两种细胞悬液等体积混合，在室温下静置5分钟，使细胞聚集。
4. 加入50%聚乙二醇（PEG）溶液，使溶液终浓度为1.5%，混合均匀，静置5分钟。
5. 加入无菌水，终止PEG诱导，充分混匀。
6. 将混合细胞悬液接种于载玻片上，用盖玻片覆盖。
7. 将载玻片放入二氧化碳恒温培养箱中培养，观察细胞融合情况。
六、实验结果：1. 在显微镜下观察到，细胞在PEG诱导下发生聚集，部分细胞开始融合，形成双核或多核细胞。
2. 经过一段时间培养，部分双核或多核细胞进一步融合，形成更大的细胞。
七、实验讨论：1. 细胞融合实验中，PEG诱导剂的作用是促进细胞质膜发生可逆性改变，使细胞易于融合。
2. 细胞融合过程中，细胞的行为与变化包括细胞聚集、质膜融合、细胞核融合等。
3. 实验结果表明，PEG诱导细胞融合效果较好，可以应用于细胞融合研究。
八、实验总结：本次实验成功实现了小鼠成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的融合，掌握了PEG诱导细胞融合的方法。
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细胞融合的原理与技术摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。
1.细胞融合原理细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。
细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。
体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。
细胞融合大体分三个阶段进行。
第一阶段是制出细胞融合体。
首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。
原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。
第二阶段是融合子的鉴定。
利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。
第三阶段是培养融合细胞阶段。
融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。
1.1动物细胞融合一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。
1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。
当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。
他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。
1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。
1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。
从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。
然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。
1.2植物细胞融合植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。
但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。
直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。
1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。
20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。
1.3微生物细胞融合1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。
2.细胞融合技术细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。
2.1化学诱导融合2.1.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。
盐类融合剂对原生质体的破坏小。
今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。
2.1.2高钙和高 pH值融合法Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。
Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。
提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。
2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)1974 年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。
聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。
为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。
因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。
影响原生质体融合的因素很多。
特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。
一般来讲钙、镁离子有助于融合。
如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。
但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。
这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。
PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。
虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。
2.2 物理诱导融合2.2.1 细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。
在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。
当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。
细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ；第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。
根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。
非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。
主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。
非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。
细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。
只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。
与使用PEG的化学法相比，电融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法。
电融合技术的优点在于：融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程。
故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。
该方法的缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。
2.2.2 激光诱导法激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。
即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。
这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。
使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。
目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。
激光微束融合法与病毒法、PEG法、电融合法相比较，可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定位性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌，无毒性。
但它只能逐一处理细胞，不能像其他方法一样同时处理大量细胞。
而且由于其所需设备昂贵复杂，操作技术难度大，很难推广应用。
在微生物原生质体融合中应用激光微束技，融合效率较低且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合技术仍处在发展初期，还有待进一步完善。
2.3生物诱导融合(仙台病毒(HvJ)诱导法)1962年日本的冈田善雄(Okada)偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。
细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重。
1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合。
自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。
但是，利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。
目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。
2.4新细胞融合技术2.4.1离子束细胞融合技术雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80 年代中期，中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。
在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。
由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性高，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。
此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。