体内药物分析测定前生物样品的预处理及定量分析方法
体内药物分析(2)
体内药物分析(2)
生物样品的前处理方法
(一)去除蛋白质
在测定血样时，首先应去除蛋白质。
去除蛋白质可使结合型的药物游离出来，以便测定药物的总浓度;去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能(如保护HPLC柱不被沾污)，延长使用期限。
去除蛋白法有以下几种。
1.加入与水相混溶的有机溶剂
可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。
常用的水溶性有机溶
剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
2.加入中性盐
使溶液的离子强度发生变化。
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。
常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。
体内药物分析样品前处理(final)
23
四. 固相萃取法
• 普通C18固相萃取的局限性 去湿效应(De-wetting Effect); 固相萃取材料耐受pH范围较窄(2-7); 对极性化合物保留差； 碱性化合物回收率较低（由于少量未键合的硅羟基所致）。
24
四. 固相萃取法
• HLB (Hydrophilic - Lipophilic Balance Copolymer) 材料的优点
平衡/活化: 甲醇/水
上样
清洗1: 2% 甲酸 (锁定目标化合物) 清洗2: 100% 甲醇
(强洗步骤) 洗脱: 2% 氨水在甲醇中
(释放目标化合物)
蒸干/重新溶解 (视具体情况而定)
30
k’
四. 固相萃取法
• Oasis MAX
AAcids (HA)
Neutral B
Bases (BH+) 0 2 4 6 8 10 12 14
N
O
pH 0 -14
Hydrophilic monomer
Lipophilic monomer
水可侵润(water wettable); 具有反相保留能力; pH 1-14范围内稳定; 没有裸露硅羟基。
Lipophilic RP Retention
NO
Hydrophilic Retention of Polars
8
一. 样品前处理技术简介
非液态样品 （组 织，器官，干血 点采集样品 DBS）
液态样品 （血 浆，尿液，组织 匀浆液等等）
直接稀释 （所有 物质均被提取）
蛋白沉淀（除蛋白）
液-液萃取（极性类 似的化合物被提取）
固相萃取（同类结构 化合物被提取）
免疫亲和提取（只有 目标化合物被提取）
体内药物分析测定前样品处理以及测定的基本程序
体 内药 物 分析 是药 物 分析 的重 要 分 支 ，是 一 门 研究 生 物 机 目前 ， 较 为 常见 的 Ｓ Ｐ Ｍ Ｅ方 法有 直接 取样 （ ｄ ｉ ｒ ｅ ｃ ｔ — Ｓ Ｐ ＭＥ ） 和 顶 ｈ ｅ ａ ｄ — ｓ ｐ ａ ｃ ｅ Ｓ Ｐ ＭＥ ， Ｈ Ｓ —ｓ Ｐ Ｍ Ｅ ） 。直接 取 样 是将 萃 取 头 直 体 中 药物 及 其代 谢物 和 内源 性物 质 的质 与量 变化 规 律 的分 析方 空 取样 （ 法学 １ １ １ 。它 是 通过 分析 人 或动 物体 液及 各组 织 器官 中药 物 及 其 接插 入 液体 样 品 中或暴 露 于空 气 中 ，待测 物 直接 从 样 品 中转 移 代 谢 物浓 度 ， 了 解药 物在 体 内数 量 和质量 的变 化 ， 获 得药 物 代谢 到涂 层 上 ， 适用 于 大多 数有 机化 合 物 的检 测 。 王 琦玮 等ｌ Ｏ ｌ 在 同相 动 力 学 的各 种参 数 和转 变 ， 以 及代 谢 的方 式 、 途径 等 信 息 ， 从 而 微 萃 取 一 气 相 色 谱 质 谱 法 测 定 血 浆 中 氯 氮 平 的 实 验 中 ，使 用 Ｄ Ｍ Ｓ 萃 取 头 直 接 取 样 的方 法 检 测 人 血 浆 中氯 氮 平 的浓 度 ， 实 有 助 于药 物 的研 究 、 临床 合 理应 用 等口 ｌ 。体 内药 物 分析 特点 是 样 Ｐ 准 确度 好 、 操作简便 ， 适 用 于 氯 氮平 急 性 中 品成 分复 杂 ， 被 测组 分含 量低 ， 因此 ， 测 定前要 对 样 品进 行 处理 ， 验 结果 的灵 敏 度 高 、
从 而 达到 从 活 体组 织 中取 样 的 目的 ， 通 过 洲 传统 的 生物 样 品处 理方 法有 沉淀 蛋 白 、 离心 和 过滤 、 液液 萃 被连 续 不 断地 带 出 ， 取等 ， 这 些 方法 虽 还 在广 泛 使 用 ， 但 它们 不 利 于在 线 处 理 、 实 现 定 流 出液 即透 析 液 中待 测 物 的浓 度 来 研 究 组 织 中待 测 物 水 平 ，
07体内药物检测与药品检验方法-药物分析
在杂质可获得的情况下，对于含量 测定，试样中可加入杂质或辅料，考察 测定结果是否受干扰，将含有杂质或降 解产物的试样进行测定，与另一个经验 证了的或药典方法比较结果。
检验方法验证>>
四、检测限 检测限系指试样中被测物能被检测出的
最低量。常用的方法如下。 1．目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠
解产物、辅料等)可能存在下，采用的 方法能准确测定出被测物的特性。
检验方法验证>>
1．鉴别反应 应能与可能共存的物质或结构相似化
合物区分。不含被测成分的样品，以及 结构相似或组分中的有关化合物，均应 呈负反应。
检验方法验证>>
2．含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离方法，应附代表性
图谱，以说明专属性。图中应标明诸成 分的位置，色谱法中的分离度应符合要 求。
（1）血浆的制备
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、草 酸盐、枸橼酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中， 混合后，以2500～3000rpm离心5~10min使与血 细胞分离，分取淡黄色的上清液即为血浆。
药物分析>>体内药物分析
（2）血清的制备 P？
贮藏采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立
即进行检测。如不能立即测定时，应根据药物在血样 中的稳定性及时处置止于具塞玻璃试管或EP管中密塞 保存。短期保存时置冰箱（4℃）中，长期保存时要在 冷冻橱（库）（－20℃）中冷冻保存。 。
放射免疫的灵敏度最高，是在生物样品中加 入理化性质、免疫学特性和待测物相同的经放射 性性同位素标记的待测物，将该待测物与特异性 的抗体结合，用测量放射性的方法测量并计算结 合部分与游离部分的比值，从而确定待测物的量。
体内药物分析中的样品预处理技术
体内药物分析中的样品预处理技术体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定量分析。
通常药物进入体内后，其化学结构与存在状态就可能发生显著变化。
在体液中，药物的存在形式多样化，除游离型的原料药物或其代谢物，也有原形药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等内源性小分子经共价结合的结合物（或缀合物），还有与蛋白质分子经氢键及其他分子间力结合的结合型药物；而且药物及其代谢物的浓度通常很低、干扰物质多。
因此，在测定时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境和条件。
常用的样品前处理方法有：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集及微波萃取和微透析技术等。
一、体内样品种类：体内药物分析采用的体内样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。
这些大都具有：①采样量少；②待测物浓度低；③干扰物质多的特点。
二、体内样品预处理的目的：⑴使待测药物游离，以便测定药物或代谢物的总浓度；⑵满足测量方法的要求，纯化浓集样品；⑶保护仪器性能、改善分析环境。
三、常用生物样品预处理技术：⒈有机破坏法：湿法破坏：电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化法干法破坏：高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法氧瓶燃烧法⒉去蛋白质法：溶剂解法（加入与水相混溶的有机溶剂）、加入中性盐、加入强酸、加入含锌盐或铜盐的沉淀剂、超滤法、酶水解法、加热法⒊分离、纯化和浓集法：液﹣液萃取法、固相萃取法⒋缀水物的水解法：酸水解法、酶水解法⒌化学衍生化发：硅烷化、酰化、烷基化、紫外衍生化、荧光衍生化、点化学衍生化、生成非对映异构体衍生化发四、新兴生物样品预处理技术：⒈微波消解⒉自动化固相萃取⒊固相微萃取⒋液相微萃取⒌微透析技术⒍超临界流体萃取⒎分子印迹固相萃取这里就固相微萃取技术和超临界流体萃取技术进行简单说明：⑴固相微萃取固相微萃取( Solid phase micro2-extraction,SPME) 是80年代末发展起来的样品预处理方法, 其装置简单, 操作方便, 已实现自动控制, 适用于现场分析。
体内药物分析测定前样品的处理以及测定的基本程序
2012年1月内蒙古科技与经济Januar y 2012 第2期总第252期Inner Mongolia Science T echnology &Economy No .2Total No .252体内药物分析测定前样品的处理以及测定的基本程序X侯海玲,郭宝凤(内蒙古医学院,内蒙古呼和浩特 010059) 摘 要:本文综述了体内药物分析测定前样品的处理方法选择的一般原则、预处理的一般方法和预处理新技术的应用进展,以及体内药物分析测定的基本程序和分析技术,为体内药物的分析提供依据。
关键词:体内药物分析;预处理;基本程序 中图分类号:T Q 460.7+2 文献标识码:A 文章编号:1007—6921(2012)02—0125—02 体内药物分析是指通过采用不同的分析技术,对体内不同体液和组织的药物进行分离和分析,从分子、细胞水平来探索药物的体内动力学过程、药效学和毒理学机制[1]。
1 体内药物分析测定前样品的处理1.1 体内药物分析测定前样品处理方法选择的一般原则[2]生物样品的前处理方法涉及许多方面,但主要应考虑生物样品的种类、被测定药物的性质、浓度和所采用的测定方法等三方面的问题。
1.2 体内药物分析测定前样品的处理方法1.2.1 蛋白质的去除[2]。
蛋白质的去除方法包括加入与水混溶的有机溶剂、加入沉淀剂、酶解法等。
1.2.2 有机破坏[3]。
生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难用溶剂萃取,所以当测定生物样品中的金属离子时,多采用有机破坏的方法进行前处理。
1.2.3 分离、纯化与浓集。
对于浓度较高的样品,或检测方法基于足够的灵敏度时,生物药品在经过去除蛋白质或缀合物等前处理步骤后即可直接用于测定。
但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时,生物样品需进行分离、纯化与浓集处理[3]。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。
萃取法包括液-液萃取法(LLE)和固相萃取法(SP E)。
其中,LLE 的优点在于它的选择性,这是依赖于有机溶剂的选择;其缺点在于乳化现象的产生[4]。
药物分析-体内样品分析的前处理
2. 固相萃取法
(1) 固相萃取法的原理 (2) 固相萃取法操作步骤 (3) 注意事项 (4) 固相萃取法的特点 (5) 自动化固相萃取
(1) 固相萃取法的原理
含药物体内样品通过小柱时, 受到 “吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力 作用, 药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)
洗脱方式有两种: ①冲洗溶剂洗去干扰物, 再用对药物 亲和力更强的溶剂洗脱药物; ②药物直接被洗脱, 干扰物保留
(1) 溶剂的选取原则
①对药物分子未电离形式可溶, 对电离形式不溶；
②沸点低,易挥发;
③与水不相混溶;
④无毒, 不易燃烧; ⑤具有化学稳定和惰性; ⑥不影响紫外检测
①辅助试剂的使用 乙醚(1.2%水): 氯化钠
②混合溶剂的使用 正己烷-异丙醇(95:5)
溶剂
紫外截止波长 (nm)
沸点(℃)
正己烷
210
69
环己烷
210
81
甲苯
285
111
↓ 异丙醚* 极 性 乙醚*
220
68
220
35
增 醋酸戊酯 加 ↓ 三氯甲烷
285
149
245
61
甲基异丁基酮
230
116
醋酸乙酯
260
77
正丁醇
215Βιβλιοθήκη 118*:含过氧化物；:肝脏毒性, 有致癌作用
(2) 溶剂的用量
有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1
对于单个样品处理, SPE操作省时 对于大量样品的处理
半自动SPE: 萃取过程机械化 全自动化仪器: 通过柱切换技术
实现固相萃取与HPLC联用
(5) 自动化固相萃取法 柱切换: 固相萃取-LC/MS/MS
体内药物分析技术的研究进展
体内药物分析技术的研究进展摘要】本文通过查阅近年来国内外有关体内药物分析理论的文献，结合个人的实践经验和认识，对其测定前样品的处理以及测定的基本程序等方面进行了综述。
【关键词】体内药物分析样品处理样品测定体内药物分析是药物分析的重要分支，具有自身独特的理论体系。
该理论是研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学，从而获得药物代谢动力学的各种参数、及代谢的方式、途径等信息，有助于药物的研究和临床合理应用[1]。
1 体内药物分析中的样品预处理体内药物分析的样品成分复杂，被测组分含量低。
因此，测定前样品需经过分离、纯化、富集、改变属性等处理后，方可进行测定。
根据样品的种类、所用的测定手段、被测药物的种类及浓度等不同，预处理方法各异。
1.1 预处理的基本理论[2]1.1.1 预处理的一般原则体内药物分析中的样品预处理方法的选择，主要依据生物样品的类型、药物的结构及性质及测定方法的种类等。
例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品主要采用离心去除粘蛋白沉淀等。
药物的酸碱性（PKa）与溶解性涉及到药物的萃取手段；药物在样品中的浓度相差悬殊，浓度大的样品对前处理要求稍低，浓度越低则样品前处理要求越高等。
放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和专属性，生物样品只需经初步处理去除主要干扰物质后即可直接用于测定；而高效液相色谱法，为防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积，上柱前需对生物样品进行去蛋白或进行溶剂萃取或制备衍生处理等。
1.1.2 预处理的基本方法1.1.2.1 蛋白质的去除沉淀蛋白的方法有多种，依据沉淀试剂种类的不同，析出的蛋白质的形状亦不同，且所得上清液的pH值也稍有差别。
例如，加入与水混溶的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键放生变化而使蛋白质凝聚；加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化，蛋白质脱水而沉淀；加入强酸及含锌盐及铜盐的沉淀剂，使溶液的pH值异于蛋白质的等电点，蛋白质以不溶性盐形式析出；此外，测定一些与蛋白结合牢固或形成缀合物的药物时，常采用有机破坏、酶解、酸水解或酶水解等方法，使被测药物得以释出。
体内药物分析方法
3．明确测定目的、要求
目的
药浓监测 药代动力学研究
母体药物和代谢物 4．结合实验室条件 设备条件 预处理方法
三、分析方法的建立
1．纯品进行测定
确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T） 2．空白样品测定
确定空白样品是否有干扰
3．以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等
阳离子：NH2+
反离子烷基或芳基磺酸盐
（5）提取技术
一般在试管中进行 有机相与水相比1:1或2:1
（6）乳化问题 措施
①轻缓振摇 ②含有分散度大或不溶物应过滤掉
③避免在高pH条件下，从水中提取药物 ④避免使用易发生乳化的溶剂 ⑤萃取剂水中加入少量NaCl
破孔方法
①机械法 ②加入少量高级脂肪醇 改变表面张力
一般要求绝对回收率在≥70%
一般方法
HPLC内标
反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化
6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态
③上样
④分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 ⑤洗脱待测物 改变pH或极性
（2）影响固相萃取的因素
（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低
柱处理 5~10ml·min-1
洗脱 0.2~1ml·min-1（〈300mg〉 2~5ml·min-1（>300mg）
有效
研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新
药
研究药物相互作用机制 有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰
2．药物代谢的途径
第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极 性增加，水溶性增强
第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、 硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结 合过程通常使药物灭活。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证1.血浆血浆样品处理方法主要包括离心、超滤、蛋白沉淀和固相萃取。
首先，通过离心将血清和细胞分离，并将上清液收集。
然后，使用超滤技术去除高分子物质，如蛋白质，以得到更纯净的血浆样品。
接下来，可以使用蛋白沉淀方法去除血浆中的蛋白质，以便进一步分析非蛋白质药物。
最后，固相萃取是常用的药物浓度测定方法，可以通过固相材料吸附目标药物，然后用洗脱液洗脱和浓缩样品，最后定量分析。
2.尿液尿液样品处理方法常采用固相萃取、pH调节、加入稳定剂等技术。
固相萃取可以去除尿液中的杂质，并将药物萃取到固相材料上，然后用洗脱剂将药物洗脱出来。
pH调节可以使药物离子化或去离子化，以提高其固相萃取的效率。
此外，加入稳定剂可以保持样品的稳定性，防止药物分解或降解。
3.组织和细胞组织和细胞样品处理方法包括离心、组织切割、细胞溶解和蛋白沉淀等技术。
首先，通过离心将组织或细胞分离，并收集上清液。
然后，使用组织切割技术将组织样品切成适当的大小。
对于细胞样品，可以使用细胞溶解剂将细胞完全裂解。
最后，蛋白沉淀可以去除样品中的蛋白质，以便进一步分析非蛋白质药物。
方法学验证是为了确保分析方法的准确性和可靠性而进行的步骤和操作流程的验证。
主要包括以下几个方面：1.线性范围验证：验证方法在一定浓度范围内，药物浓度与测定结果之间的关系是否呈线性。
2.灵敏度验证：验证方法的最低检测限、最低定量限和测定范围等指标，以评估方法对药物浓度的敏感度。
3.精密度和准确度验证：通过重复测定和与参考方法比较等方法验证方法的重复性和准确性。
4.选择性验证：验证方法对样品中其他可能存在的干扰物的选择性，以保证药物的测定不受干扰。
5.稳定性验证：验证样品在不同温度、时间、pH条件下的稳定性，以评估样品的保存期限和条件。
综上所述，体内药物分析常用的生物样品处理方法包括血浆的离心、超滤、蛋白沉淀和固相萃取，尿液的固相萃取、pH调节和加入稳定剂，组织和细胞的离心、组织切割、细胞溶解和蛋白沉淀等。
体内药物分析测定前生物样品的预处理及定量分析方法
宴游之乐(醉人)
心情：禽鸟乐——人之乐——乐其乐 与民同乐(醉情)
可取之处
重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学
之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，
翻译训练1．学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节
到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊
于《岳阳楼记》的千古名篇——《醉翁亭记》。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导
易
三、体内药物分析测定前生物样品的预处理
样品种类 常用的样品的种类包括血样,唾液和尿液 血样是指全血、血浆或血清,一般情况下血浆分 离快、易得,故最常用 唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔黏膜内 腺体分泌的 尿药浓度测定主要用于剂量回收、药物代谢和 生物利用度等研究 脏器组织，除非特别需要，在临床治疗药物监 测中很少使用
1．在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2．反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，
形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形
体内药物分析实验
体内药物分析实验预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制1.HPLC法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1目的要求1.掌握血浆样品的前处理方法。
2.熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。
3.熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。
1.2 主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品，黄芩素（baicalein），抗坏血酸，肝素，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase），分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格移液枪（5, 20, 50, 100, 200, 1000μL）和容量瓶（10，25mL），5~10mL 具塞离心管若干；雄性SD大鼠（180~220g）。
1.3 实验原理山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。
由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。
实验以黄芩素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。
1.4 实验方法1.色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），配保护柱，柱温40℃；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速1mL/min；检测波长370nm；进样量20μL。
2.溶液配制：取山奈酚对照品约2.5mg，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。
精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30μg/mL的标准系列溶液，置4℃冰箱保存。
另取黄芩素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液，精密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置4℃冰箱保存。
3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品120μL，加入甲醇20μL、1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32μL、β-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50μL，37℃水浴温育30min后，加入内标溶液50μL，然后加无水乙醚2mL，漩涡混合5min，于12000r/min离心5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用100μL 甲醇复溶，12000r/min离心5min，取上清液进样分析。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
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萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！
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固相萃取操作一般有五步：
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
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实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化， 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
体内药物分析生物样品与样品制备
体内药物分析生物样品与样品制备
生物样品是指人体或动物体内的生物组织、体液以及排泄物等样品。
常用的生物样品有血液、尿液、唾液、头发、毛发等。
生物样品的选择要根据分析目的和药物的特性来确定。
例如，如果需要了解药物在机体内的浓度变化情况，可以选择血液样品进行分析；如果需要了解药物的排泄情况，可以选择尿液样品进行分析。
样品制备是体内药物分析的重要环节之一、样品制备的目的是将生物样品中的药物分离出来，以便后续的分析和检测。
常用的样品制备方法有固相萃取、液液萃取、凝胶过滤、超滤和离心等。
具体选择哪种方法要根据药物的特性和样品的性质来确定。
在体内药物分析中，分析方法的选择很重要。
常用的分析方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、质谱法（MS）等。
这些方法可以用于测定药物的浓度、代谢产物、分布情况等。
分析方法的选择要根据样品的性质、药物的特性和分析目标来确定。
体内药物分析常用的指标包括药物浓度、药物代谢产物的生成率、生物样品中药物的分布情况等。
这些指标可以通过分析样品中药物的浓度、代谢产物的生成率以及其他相关指标来获得。
通过对这些指标的测定和分析，可以对体内药物的代谢和排泄等过程进行研究，从而了解药物的药效和药代动力学特性。
总之，体内药物分析是研究药物在机体内吸收、分布、转化和排泄等过程的重要手段之一、通过对生物样品进行分析和检测，可以了解药物的代谢和排泄情况，为药物的研发和应用提供科学依据。
样品制备和分析方法的选择对于体内药物分析的结果和准确性起到至关重要的作用。
体内药物分析样品前处理(final)
沉淀剂 10% 三氯乙酸水溶液 （体积体积比） 10% 硫酸锌水溶液 （重量体积比） 饱和硫酸铵水溶液 （室温下） 乙腈 乙醇 甲醇
沉淀剂-血浆 体积比 0.5 2 3 1.5 3 2.5
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二. 蛋白沉淀法
在96孔板中加入标准曲线样品， 质控样品和未知样品各50µL
Oasis® WCX
Oasis® WAX
C O OH
COO- + H+
pKa ~5
NO
N
N H
NO
H
N+ N+
HH
pKa ~6
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四. 固相萃取法
• Oasis WCX
WCX neutral state
Acids (HA)
Q+
utral
B
Q+
Bases (BH+)
A-
0 2 4 6 8 10 12 14 pH
14
三. 液-液萃取法
• 常见的亲水与亲脂官能团
官能团名称 亲水性基团 羟基 胺基 羧基 酰胺基 胍基 烷氨基 硫酸盐
结构，举例
-OH -NH2 -COOH -CONH2 -NH(C=NH)
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三. 液-液萃取法
• 常见的亲水与亲脂官能团 (续表)
官能团名称 亲脂（亲油）性基团 碳-碳键 碳-氢键 碳-（卤族元素）键 烯烃族化合物 芳香族化合物
Oasis® HLB
NO
Oasis® MCX
Oasis® MAX
- SO3 pKa <<1
NO
CH3
CH2N+-C4H9
药学科学分析化学药物分析学药物分析学生物体1
为新药研制、药品生产和临床应用等方面的 研究提供必要的实验研究手段、作出科学的 估计与评价。
a
5
体内药物分析 Biopharmaceutical Analysis Biomedical Analysis
生物药物分析 体液药物分析
药物动力学特征
样品前处理
纯化富集待测组分
（3）病理状态（如胃肠道疾病影响药物的吸收、肝脏 疾病影响药物的代谢、肾脏疾病影响药物的排 泄），对某些药物进行血药浓度监测。
（4）药物的毒副反应与疾病本身症状相似，如地高 辛——房颤毒性反应，监测血药浓度，增减剂量。
a
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3.在药代动力学(Pharmacokinetics)研究中的应用
药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分 布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药 浓度－时间曲线的变化，探讨药物分布与药 理作用的关系;
药物 卡马西平 地高辛 苯妥英 扑米酮 茶碱 苯巴比妥 氨基比林 安替比林 锂盐
a
34
血浆plasma/血清serum： 直接与组织液接触并达到平衡，直接反
映作用部位药浓变化，血浆的使用频率高于 血清; 全血：
血浆/血清中的药物浓度 + 血细胞(贮存 库，一般无药理作用）中的药物浓度。
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尿样Urine
➢特点1：尿药浓度通常变化较大； ➢特点2：尿药大多呈结合状态； ➢优点1：易得，且样品量多； ➢优点2：正常尿液仅含微量蛋白； ➢缺点1：尿液是一种良好的细菌培养基； ➢缺点2：尿液中多具有紫外吸收的化合物。
男性（n=15） 6.07±4.05 39.37±13.95 9.79±8.81 （21-48岁）
女性（n=15） 4.45±3.37 28.93±8.85 11.45±10.86 （18-60岁）
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样品的贮藏
血样、唾液取样后如不能立测定时,短期保存时 可置冰箱(4℃)、长期保存时需在-20℃或-80℃冷 藏。全血未经分离时, 不宜直接冷藏保存。
尿液若需收集2预处理4小时或更长时间的样品 或不能立即测定的, 应加入防腐剂后置冰箱中冷藏 保存。
样品的制备,即样品的预处理
样品通常在最后测定前要采取适当的样品制备, 即进行分离、纯化、浓集三步,必要时尚需对待测 组分进行化学改性,为测定创造良好条件。
关于“醉翁”与“六一居士”：初谪滁山，自号醉翁。既老而衰且病，将退休于颍水之上，则又更号六一居士。客有问曰：“六一何谓也？”居士曰：“吾家藏书一万卷，集录三代以来金石遗文一千卷，有
琴一张，有棋一局，而常置酒一壶。”客曰：“是为五一尔，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之间，岂不为六一乎？”写作背景：宋仁宗庆历五年(1045年)，参知政事范仲淹等人遭谗离职，欧阳
体内药物分析测定前样品的处理方法 蛋白质的去除
包括加入与水混溶的有机溶剂、加入沉淀剂、 酶解法等。
有机破坏 当测定生物样品中的金属离子时, 多采用有机
破坏的方法
分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏
度不够高时, 生物样品需进行分离、纯化与浓集 处理，萃取法是应用最多的分离、纯化方法。
体内药物分析测定前生物样 品的预处理及定量分析方法
一、体内药物分析的定 义
体内药物分析是指通过采用不同的分析技 术,对体内不同体液和组织的药物进行分离和 分析,从分子、细胞水平来探索药物的体内动
力学过程、药效学和毒理学机制。
二、体内药物分析的特点
干扰杂质多 样品量少，不易重新获得 药物浓度较低，对方法灵敏度和专属性要求高 检测分析方法，要求简便、快速、准确 实验室应拥有多种仪器设备 工作量大，测定数据的处理和阐明有时不太容
易
三、体内药物分析测定前生物样品的预处理
样品种类 常用的样品的种类包括血样,唾液和尿液 血样是指全血、血浆或血清,一般情况下血浆分 离快、易得,故最常用 唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔黏膜内 腺体分泌的 尿药浓度测定主要用于剂量回收、药物代谢和 生物利用度等研究 脏器组织，除非特别需要，在临床治疗药物监 测中很少使用
到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊
于《岳阳楼记》的千古名篇——《醉翁亭记》。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导
仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什
么不能划分为“山/行六七里”？
明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。“望之/蔚然而深秀者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望
学一：认识作者，了解作品背景作者简介：欧阳修(1007—1072)，字永叔，自号醉翁，晚年又号“六一居士”。吉州永丰(今属江西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世
称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。
11 醉翁亭记
1．反复朗读并背诵课文，培养文言语感。
2．结合注释疏通文义，了解文本内容，掌握文本写作思路。
3．把握文章的艺术特色，理解虚词在文中的作用。
4．体会作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、导入新课范仲淹因参与改革被贬，于庆历六年写下《岳政治理想。实际上，这次改革，受
修上书替他们分辩，被贬到滁州做了两年知州。到任以后，他内心抑郁，但还能发挥“宽简而不扰”的作风，取得了某些政绩。《醉翁亭记》就是在这个时期写就的。目标导学二：朗读文章，通文顺字
1．初读文章，结合工具书梳理文章字词。2．朗读文章，划分文章节奏，标出节奏划分有疑难的语句。节奏划分示例
环滁/皆山也。其/西南诸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，琅琊也。山行/六七里，渐闻/水声潺潺，而泻出于/两峰之间者，酿泉也。峰回/路转，有亭/翼然临于泉上者，醉翁亭也。作亭者/谁？山之僧/曰/智
免疫分析法特别适用于色谱法难以分析的药物
五、展望
近年来体内药物分析发展迅速,各种新方法、新 技术的联合使用使得从样品的采集、处理、分离 到检测完全自动化成为了现实 , L c - MS / MS 、 L c - N MR、LC - N MR / MS等的联合正深刻改 变并推动着体内药物分析的发展 , 采集样品的无 损化、微量化、获得信息的高通量化在线化,试剂 消耗的低量化,已成为今后体内药物分析发展的新 方向,体内药物分析将受到越来越多的关注与重视。
样品的预处理是体内药物分析中最复杂最繁琐 也是最重要的一步, 目的主要是排除干扰, 提高分 析灵敏度
定量分析
荧光分析法 利用物质发射荧光的特性进行分析的光学分析
法。其优点是灵敏度高、选择性好等。 高效液相色谱法 ( HP LC)
它是以经典液相色谱为基础,以微粒型填料作固 定相,采用高压送液泵和各种高灵敏度检测器。具 有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等特 点。 免疫分析法
四、体内药物分析测定的基本程序
采样 样本贮存 样本制备 待测物的分离和鉴别 最后的定量分析
样品的采集
目前的采集样品多为血液和尿液 所用方法有室灌流法、灌流引流法、皮层造室 灌流法等, 但是这些方法有一个共同的缺点, 就是 对组织和器官有明显的损伤,并需在麻醉的状态下 试验。 近年来,出现微透析法采集样品, 微透析可应用 于任何组织和器官,对组织无明显的伤害,可以研究 在非麻醉状态下动物体内各种微环境的变化。