过氧化氢酶活力的测定实验报告doc

过氧化氢酶活力的测定实验报告

篇一：过氧化氢酶活性测定

实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦叶片

（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。

（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.

0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。

三、实验步骤

（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。

用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

四、结果计算

酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W ×VS×1.7×t)

式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；

VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；

1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2。

过氧化氢酶的活性测定

在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸

作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用，

而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H2O2，是植物体内重要的活性氧清除系统之一。其活

性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，

在此过程中起传递电子的作用，H2O2则既是氧化剂，又是还原剂。

R(Fe+2)＋H2O2=====R(Fe+3OH-)2

R(Fe+3OH-)2＋H2O2===R(Fe+2)2＋2H2O＋O2

合并上式：2H2O2====2H2O＋O2

据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸

钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4

即可求出消耗的H2O2量。

二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶

三、试剂：

10％H2SO4；0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；

0.1mol/l高锰酸钾标准液： 3.1605gKMnO4 (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml，用

0.1mol/l的草酸溶液标定；

0.1mol/l H2O2：市售30％H2O2大约等于17.6mol/l，取30％H2O2溶液5.68ml稀释至

1000ml，用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。

四、方法：

1. 酶液提取：取小麦叶片

2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml

容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，

上清液即为过氧化氢酶粗提液。

2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液

2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加

入10％H2SO4 2.5ml。

3. 用0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。

4. 结果计算：

酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示：

(A-B)*Vt/V1*1.7

酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜重）＝-------------------

W

式中：Ａ-----对照用KMnO4 ml数Ｂ-----酶反应后KMnO4滴定ml数

Ｖt----酶液总量mlＶ1----反应所用酶液量mlＷ-----样品鲜重(g)

1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O2

[注意]．所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l H2O2要新配制。

实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密