固定化酶

1.2 脂肪酶的研究与应用

1.2.1 脂肪酶的研究概况

脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。

作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。

1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制

脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。脂肪酶是一种很有前途的富集催化剂，但脂肪酶的脂肪酸特异性较差。

在脂肪酶催化酯键水解的过程中，活性酶的构象和四面体跃迁态的稳定都是至关重要的。利用蛋白酶定点突变实验的x射线结构数据和结果已被用作预测可

能在脂肪酶中起关键作用的氨基酸残基的基础。克隆了根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌中表达。该基因的定点突变被用来测试计算机辅助预测特定氨基酸在该酶中的功能作用的有效性。通过对米根霉脂肪酶变异体的动力学常数的检测，我们可以识别出直接参与催化反应或稳定酶活性几何结构的氨基酸残基。这些结果与分子力学模拟相结合，基于同源衍生的结构模型，提供了关于结构-功能关系的新信息。对数据的解释与其他水解酶(如蛋白酶)的结果一致。

1.3 固定化酶

1.3.1 固定化酶的意义

固定化酶是相对于游离酶而言，是指将能自由移动的游离酶限定不能自由活动的过程，常被用于修饰生物酶。固定化酶的主要作用是提高酶的产酶率和操作稳定性，同时促进酶的再利用。因此，作为生化催化剂，固定化酶相比游离酶有着先天的优势，其反应过程更简单、更容易操作、可多次使用、成本相对低廉、催化速度更快、不易污染、更易于从反应混合物中分离而不污染产物等。

1.3.2 固定化酶的制备方法

酶固定化方法大体上可以分为物理法和化学法，其中物理法包括吸附法、包埋法；其余比如交联法、结合法、离子法属于化学方法。

1.3.

2.1 物理方法

（1）吸附法

吸附法一般指的是包括离子吸附在内的物理吸附。物理吸附指将酶附着于载体上，它不改变酶的结构，酶的活性几乎不受影响，酶的活性保持较好。但也有缺点，就是酶与其载体连接性不够好，容易分离，而且吸附后产生酶的活性不够高。

离子吸附属于特殊的物理吸附，其载体是特殊的水不溶性载体，和普通的物理吸附一样，活性几乎不受影响和弱化，产生的固定化酶活性，相比普通的物理吸附更高。

（2）包埋法

包埋法也是一种物理法，其不改变酶的分子结构，就是将酶包埋在孔状载体中使其固定化的过程。包埋系统条件要求较低，包埋法适用范围较广，不发生化学反应，酶的活性和稳定性保持较好。包埋法常用于污水处理，如果要用于食品、药品生产催化，对包埋材料的无毒无害性有严格要求。

1.3.

2.1 化学方法

（1）交联法

交联法是一种化学固定化酶的方法，采用交联试剂将酶内部分子、酶分子与载体分子、酶分子与惰性蛋白分子发生化学反应，形成共价键。该方法可以使包括酶在内的交联物分子结构变得更复杂，提升酶的活性和稳定性。但由于交联剂价格一般很昂贵、采用此方法成本太高，所以一般不单独使用，常结合其他方法，比如吸附或包埋法，既固化酶，又提高酶的活力。

（2）结合法

结合法无论是采用离子键还是共价键进行结合，都改变分子结构，属于化学方法。离子键结合法顾名思义采用的载体是离子交换剂，该方法操作简易、酶的活性保持较好，但是酶与载体结合不紧密，当外部环境发生变化时，容易发生分离。共价键结合法相比离子键结合法，恰好相反，操作复杂、对载体要求较高，但酶与载体结合紧密，酶不易与载体分离，使用时间相比离子键结合法能长很多。

1.3.3 新型固定化酶技术

开发新一代固定化酶，应充分利用快速发展的遗传技术、有机化学、计算化学和生物信息学、反应器和反应设计等科学技术。为了提高酶的产量，无论是独立的或作为催化级联过程，工业生物催化剂必须考虑酶的多种生物转化，从而提高成本效益。

新型固定化酶的大规模生产进展缓慢，这与它们较高的成本和储存问题有关。科学家和工业生产者需要加强合作，促使固定化酶的新矩阵和交叉连接物就可以更好地适应不同的化学过程。因此，深入了解如何实现高功能酶固定化方案非常有必要。在合适的底物支持下，需考虑到交叉连接和预先的应用等固定化生物催化剂。为了实现工业水平的绿色酶过程，需要为研究稳定酶的可用性以及酶的固定-稳定和再活化开发出有效的策略[29-31]。

1.3.3.1基于新型固定化载体的固定化酶技术

（1）金属有机框架固定化酶