RTPCR实验步骤
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤佚名一、组织抽提：1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g 4℃ 5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心<12,000g 4℃ 10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心<12,000g 4℃ 5分钟弃去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震荡11.离心<7,500g 4℃ 5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟1.65℃ 15分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时1.37℃ 1.5小时2.94℃ 5-10分钟3.反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步30个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟为第一个步1个循环2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟为第二步40个循环3.72℃ 10分钟4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）3.微波炉中火2分钟溶解胶4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.放入梳子，浇板，待凝固6.加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰7.电泳50-80V（每㎝ 5V）。
RT-PCR操作流程及其相关注意事项
RT-PCR一知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.4、引物的设计及其原则：引物的特异性决定PCR反应特异性。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR操作步骤（2008/11/7整理，ZLJ）原理：Trizol是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液，酚起到变性的作用，使蛋白变性，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶，防止RNA的降解。
（一）试剂准备1．Trizol试剂2．氯仿、异丙醇、无水乙醇（国产色谱纯）3．三蒸水（娃哈哈）4．75%乙醇（DEPC H2O配制）✓(用于擦枪等) 0.1%DEPC H2O配制。
无水乙醇500mL,倒出200ml，加入100ml的0.1%DEPC H2O。
✓（用于RNA洗涤）0.01%DEPC H2O配制。
无水乙醇500mL,倒出200ml，加入100ml的0.01%DEPC H2O。
5．DEPC H2O✓0.1%DEPC H2O(用于处理枪、枪头盒)。
用三蒸水配制。
加入体积0.1%的DEPC✓0.01%DEPC H2O (用于RNA提取最后一步)三蒸水配制,加入体积0.01%的DEPC.盖上胶塞,过夜,高压灭菌.6．PBS配制100ml，专门用于该实验。
7．TE缓冲液8．反转录试剂盒（MBI）9．Taq 酶——耐热DNA聚合酶（Takara Japen）10．dNTPs (Takara Japen)11．溴酚兰12．Marker（二）耗材准备1．Rnase-free塑料EP管。
直接使用。
2．一次性PE手套（3包）3．三种规格枪头✓处理：枪头及枪头盒，镊子、及4ml国产EP管放入饭盒中，加入0.1%DEPC H2O，浸入后，盖厚纱布，将处理的物品压入水中，盖上饭盒盖，自封袋封好，室温过液。
烘干。
灭菌30分钟。
（三）RNA提取一步法提取细胞总RNA准备试管架、1.5ml EP管架、2套1.5mLEP管、4mL处理过的EP管（数目同样品数）所有EP管标号1．收获细胞，移入4mL离心管（处理过）中，1000转离心5min，PBS洗一遍。
2．每加入1ml Trizol, 枪头反复吹打，移入1.5mLEP管中，室温静置5min。
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR具体实验步骤
品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入 DEPC 水)，过夜后取出(注意： DEPC 水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP 管和 匀浆管装入饭盒后甩干，然后在 37 度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时 间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
组织 100mg/细胞 1×107 ↓
加 1mlTRIzol ↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至 EP 管) 细胞：用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5) ↓
颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在 40-45 分钟，所以水要适当多加一 点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．琼脂糖
四．缓冲液配制 1．电泳缓冲液(5×TBE 贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加
一．实验器具： 1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml 4.EP 管：1.5ml、500μl、200μl 5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放 75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml 8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2 个 10.大瓷缸：1 个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2 卷 13.三角烧瓶：带盖，稍大
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验步骤
(1)RNA提取1、取出新鲜肝组织，放在液氮中冻存备用。
2、取匀浆器，加入lml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
3、取100mg新鲜肝组织，加入到匀浆器中。
4、充分研磨直至无可见组织块，转移到1.5ml EP管中。
(2)两相分离每lml的Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4C下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的Trizol Reagent试剂的60％。
(3)RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
(4)RNA清洗移去上清液，每lml Trizol Reagent试剂裂解的样品中加入至少lml的75％乙醇(75％乙醇用DEPC H2O配制)，清洗RNA沉淀。
混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。
(5)RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
(6)溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40u1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。
(7)测定RNA的质量1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(ug/m1)计算公式为：A260×稀释倍数×40 ug／ml。
具体计算如下：RNA溶于4u1 DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5ul用来测量以后，剩余样品RNA 为35u1，剩余RNA总量为：35u1×0.84 ug/ul=29.4 ug②纯度测定：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
RTpcr实验步骤
RT-PCR实验步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的实验技术，可以在体外合成DNA的互补链。
它广泛应用于分子生物学研究、病毒检测以及基因表达分析等领域。
下面将介绍RT-PCR实验的步骤。
材料准备在进行RT-PCR实验之前，需要准备以下实验材料：1.逆转录试剂盒：包括逆转录酶、引物、缓冲液等。
2.样品：需要包含RNA的样品，如细胞总RNA或组织RNA。
3.质控物：用于验证实验的阴性和阳性对照物。
4.相关试剂：如脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）、MgCl2、RNase抑制剂等。
逆转录反应前处理1.将RNA样品加入无RNase试剂管中，以免被RNase降解。
2.加入逆转录酶、逆转录缓冲液、dNTP、MgCl2和RNase抑制剂，轻轻混合。
反应条件1.设置逆转录反应的温度和时间：通常在50-60摄氏度下反应10-60分钟，以逆转录酶的要求为准。
2.根据逆转录酶的要求进行热变性处理，以停止反应。
PCR扩增准备PCR反应液1.在无RNase的条件下，制备PCR反应液。
组分包括引物、dNTP、PCR缓冲液和PCR酶。
2.在无样品的条件下，混合PCR反应液。
反应条件1.设置PCR反应的循环条件：包括变性、退火和延伸温度，循环次数根据需求而定。
2.在PCR反应过程中收集产物供进一步分析和检测。
结果分析通过PCR扩增获得的产物可以进行各种分析和检测。
1.凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，通过电泳图观察目标DNA的条带。
2.定量PCR：通过测定PCR反应体系中初始DNA的数量，可以计算出初始样品中的目标DNA的初始数量。
3.实时荧光定量PCR：结合荧光染料和合适的探针，可以实时监测PCR反应体系中目标DNA的扩增过程。
结论RT-PCR实验是一种重要的分子生物学技术，能够在体外合成DNA的互补链。
通过逆转录反应和PCR扩增，可以获得目标DNA的大量复制产物，并通过结果分析方法进行进一步研究。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
rt—qpcr实验原理及步骤
rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。
其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。
1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。
逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。
2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。
在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。
3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。
这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。
rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。
样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。
2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。
逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。
3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。
PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。
4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR注意：酶现拿现用，用完放回—20度先配后加，节约枪头试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此一、DNase处理：1、10ul 体系Total RNA 1ug（或者2ug） A ul10*buffer （含Mgcl2 ）1ulDNase （1U/ul）1ulDEPC free water 补足总体积10ul即为8-A ul总体积：10ul37 ℃，30分钟即Dnase Ⅰ2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）65℃，10 min，即Dnase Ⅱ备注：这一步后，共有11 ul 的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。
二、逆转录（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）1、加入，并混匀1)总RNA （含有1-2ug RNA，或者是10ul的第一步中经过DNase 处理的总RNA）10 ul2)Primer oligo（dt）18 （0.5 ug/uL）1ul3)dNTP（10mM）1ul总体积：12ul 65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ2、加入，并混匀5 x first brand buffer 4ul0.1M DTT 2ulRNA酶抑制剂（20U/uL）1ul总体积：19ul 37℃，5min（若用随机引物，则25℃，5min）即程序cDNA Ⅱ3、不等其降到4度，立即加入200U的逆转录酶，Revert Aid TM M—Mulv 1ul总体积：20ul37℃，60min 即程序cDNA Ⅲ4、70℃，10min，终止反应，冰上冷却。
注意：1)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成2)RT每步温浴前要稍微离心3)推荐的做法是DNase处理完后的RNA留用1ul，用来最后PCR的时候做对照，以排除可能的DNA污染。
三、PCR取逆转录的产物做PCR，参照普通的PCR。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE 的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR步骤
RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1) 1.5ml 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2) 静置5分钟或马上-70℃保存3) 12000 rpm 离心15分钟,分相为三层，取上清液至新1.5ml管4) 加入200ul氯仿，振荡混均30秒5) 室温静置3-5分钟分层6) 12000rpm离心15分钟，取上清液至新1.5ml管，中间层和红色下层4℃保存，便于提取DNA和蛋白质7) 上清液加入约0.5ml的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8) 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。
9) 如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10) 加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11) 8000 rpm离心5 min,弃上清12) 短暂快速离心（5秒），吸弃上清13) 室温放置2分钟晾干14) 沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15) 少量样品55-60℃孵育10～15分钟16) 测量OD A260/A280值后，样品放置－70℃保存。
(保存时间不应超过一星期)3、反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。
然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。
反转录步骤初步定为：1）0.2ml离心管加入1μl总RNA，1μl随机引物oligo(dt），10μlDEPC处理水。
2）混匀，瞬时离心5秒。
3）70℃水浴5min。
4）迅速冰浴2min。
5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul 0.1M DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。
6）混匀，温浴2min。
7）加入1 ul 反转录酶，42℃温育50min。
8）70℃孵育10min灭活。
9）-70℃冰箱。
4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤注意：酶现拿现用，用完放回—20度先配后加，节约枪头试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此一、DNae处理：1、10ul体系TotalRNA1ug（或者2ug）Aul10某buffer（含Mgcl2）1ulDNae（1U/ul）1ulDEPCfreewater补足总体积10ul即为8-Aul总体积：10ul37℃，30分钟即DnaeⅠ2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）65℃，10min，即DnaeⅡ备注：这一步后，共有11ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。
二、逆转录（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）1、加入，并混匀1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNae处理的总RNA）10ul2)Primeroligo（dt）18（0.5ug/uL）1ul3)dNTP（10mM）1ul总体积：12ul65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ2、加入，并混匀5某firtbrandbuffer4ul0.1MDTT2ulRNA酶抑制剂（20U/uL）1ul总体积：19ul37℃，5min（若用随机引物，则25℃，5min）即程序cDNAⅡ3、不等其降到4度，立即加入200U的逆转录酶，RevertAidTMM—Mulv1ul总体积：20ul37℃，60min即程序cDNAⅢ4、70℃，10min，终止反应，冰上冷却。
注意：1)RT的步骤中的温浴可以用PCR仪来完成2)RT每步温浴前要稍微离心3)推荐的做法是DNae处理完后的RNA留用1ul，用来最后PCR的时候做对照，以排除可能的DNA污染。
三、PCR取逆转录的产物做PCR，参照普通的PCR。
regularPCR备一套新PCR反应管，按顺序加入以下物质注意：1)先加H2O10.6ul，加样品DNA2ul/个（普通枪头即可）2)剩下的全部加在一个普通的EP管内（即除了H2O，DNA外其他的组分先混再加）。
rt-pcr操作流程
rt-pcr操作流程如下：
1.RNA提取：从样品（如细胞、组织、血液、唾液等）中提取RNA，
可以使用商业RNA提取试剂盒或自制方法。
2.cDNA合成：利用逆转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA转
录成cDNA（DNA的互补链），可以使用商业RT试剂盒或自制方法。
3.建立标准曲线：制备一系列已知浓度的标准品，用以构建标准
曲线，用来定量目标基因的相对表达量。
4.实时荧光定量PCR：将cDNA与引物和荧光探针（如TaqMan
探针）混合，使其在PCR过程中扩增，并且实时检测扩增产物的荧光信号强度，从而判断PCR反应的进程和结果。
5.数据分析：利用软件分析PCR扩增曲线和荧光信号数据，计算
目标基因的相对表达量和差异表达水平。
需要注意的是，RT-PCR操作需要严格控制反应条件和质量，避免污染和误差的影响。
同时，需要针对不同的样品和实验目的进行优化和调整，以获得稳定、可靠和重复的结果。
rtpcr操作流程
rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。
下面将介绍RT-PCR的操作流程。
首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。
确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。
第二步是提取RNA样本。
将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。
提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。
第三步是逆转录反应。
将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。
第四步是PCR扩增。
将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。
PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。
第五步是检测PCR产物。
将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。
通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。
最后，分析结果并进行数据处理。
根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。
对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。
总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。
正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。
RTPCR具体步骤
RTPCR具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种用于检测和测量特定RNA分子在样本或样本中的表达水平的实验技术。
下面是RT-PCR的具体步骤：1.提取RNA：首先从样本（可以是细胞或组织）中提取RNA。
这可以通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。
提取的RNA可能含有DNA杂质，因此可以使用DNA酶I来去除DNA。
2.逆转录反应：将提取的RNA转录成互补的DNA（cDNA）的过程称为逆转录。
逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA，并将其中的信息保存下来，以便后续PCR反应中进行扩增。
逆转录反应通常在逆转录酶（例如M-MLV反转录酶）和随后使用的引物的存在下进行。
需要引物来诱导逆转录酶在RNA模板上合成第一链cDNA。
3.PCR反应：PCR是一种将特定DNA片段扩增到大量可检测水平的技术。
在RT-PCR中，PCR反应用于扩增从RNA转录的cDNA片段。
PCR反应需要一对引物，这对引物应是特异性的，可以选择性地放大感兴趣的RNA分子。
PCR反应通常包含DNA模板，引物，dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和DNA聚合酶。
PCR反应包括一系列循环，每个循环都包括一定的时间和温度在一定的时间内。
4.聚合酶链反应：在PCR反应中，DNA聚合酶在每一个循环中以DNA末端为模板合成互补的DNA链。
每个循环包括退火，延伸和变性步骤。
在退火步骤中，引物结合到DNA模板上。
在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链，并以它们作为模板进一步合成更多的DNA链。
在变性步骤中，PCR反应的温度被升高以分离DNA链。
5.检测与分析：PCR反应产生的扩增产物可以通过凝胶电泳或其他检测方法进行分析。
凝胶电泳可以分离不同大小的DNA片段，并且扩增产物的相对量可以通过定量PCR（qPCR）进行测量。
qPCR使用荧光信号来检测PCR产物的积累，并通过与标准曲线相比较来确定特定的RNA分子在样本中的表达水平。
6.数据分析：通过分析PCR产物的相对量，可以根据比较样品之间的扩增产物浓度来确定特定RNA分子在样本中的表达水平。
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RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b 方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。
请教mxbdna2003，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答：itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitity ofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplat e<(forRTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorifhedonn otknowthepreoceduremuch.buttheamountjustusing"accurate piptte"iswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofh ousekeepinggeneeverytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq 酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。
有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。
不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR 做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR 本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。
我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。
烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在***帖过。
关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和着名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。
我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche 的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。
因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA 酶。
一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。