好氧反硝化细菌的筛选
好氧反硝化细菌的筛选及其在鸡粪发酵氮素转化中的作用
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好氧反硝化细菌的筛选
第5期收稿日期:2012-09-07基金项目:四川大学创新试验基金项目(379)作者简介:何为(1991-),男,四川南充人,大学本科,研究方向为微生物菌种筛选,(电话)028-********(电子信箱)heweiscu@;通讯作者,李永红,(电话)028-********(电子信箱)liyonghong@。
第52卷第5期2013年3月湖北农业科学Hubei Agricultural SciencesVol.52No.5Mar.,2013工业生产中未经处理的含氮废水的排放造成了我国河流、湖泊及海洋氮含量普遍增高,进一步导致湖泊富营养化、海洋赤潮等现象,极大地危害到水生物的生存繁衍以及人类自身的健康。
此外,农用氮肥的使用加大了地下水硝酸盐污染程度,硝酸盐可在一定条件下转化为亚硝酸盐,而亚硝酸盐极易致癌,危害人们生命。
我国地下水合格率仅为30%[1],因此,探究高效经济的脱氮工艺迫在眉睫。
传统的物化脱氮法包括吹脱法[2]、MAP 沉淀法、膜法、折点加氯法和离子交换法,主要用于高浓度含氮废水处理,而对于低浓度含氮废水而言其成本相对过高,而运用新型生物脱氮法进行低浓度废水处理则优势明显。
现阶段生物脱氮法主要包括活性污泥法[3]、固定化生物脱氮[4]以及微生物制剂[5]等,其理论技术都趋于成熟,然而其前提条件是找到一种反硝化效率较强的菌株。
本研究以江安河和府河淤泥为基础,以硝酸钾为惟一氮源,以梯度划线法和BTB 平板筛选等方法相结合进行好氧反硝化细菌的筛选,得到反硝化效率较高的菌株,并对所得菌株反硝化能力进行pH 值以及温度影响的评估,以得到菌株最适的反硝化条件,为生物脱氮提供新的菌种选择依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源从江安河和府河采取污泥样本好氧反硝化细菌的筛选何为,张岳骁,李永红(四川大学化学工程学院,成都610225)摘要:采集江安河及府河淤泥样本,采用BTB 培养基与N-(1-萘基)-乙二胺光度法筛选出20株具有反硝化能力的好氧菌株。
低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定
低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定好氧反硝化过程是在无氧条件下发生的，它在自然界，特别是水体中扮演着重要的角色，它可以有效地去除水体中氧化态氮，防止氮垂直蔓延现象。
其研究以及应用价值日趋受到重视。
近年来，由于气候变暖和空气污染，国内外陆源氮污染严重，使得硝化活性的抑制已成为当前水环境研究的主要方向之一。
因此，掌握和研究低温低碳氮比下好氧反硝化微生物的自然界分布，以及其分类学、生理特性，以及其反硝化降解能力及其功能基因的研究，将有助于分析其调控反硝化的分子机制，为抑制水体的氮污染提供科学依据，同时为好氧反硝化应用提供技术支持。
低温低碳氮比下好氧反硝化菌的筛选鉴定一般有多种途径，其中主要包括分子生物学技术、细胞生物学技术和底物浸泡-无氧脱氮法。
多种分子生物学手段可用于研究指定的好氧反硝化菌的定量和定性，检测其真菌等类型，以及其反硝化DNA序列，并进行克隆定序。
细胞生物学技术可用于研究传统的好氧反硝化菌离子力学性质，特别是其对氧化态氮，特定氧化剂以及不同底物的反硝化特性，以及其他有利气体，离子营养物质和其他反硝化因子的吸收特性。
底物浸泡-无氧脱氮法是一种通过浸泡或淋洗被研究物质，再经过长时间的放置，使其无氧状态下，而有效地去除土壤中的氮素，以测定好氧反硝化菌的反硝化能力。
此外，反硝化实验室可以根据样品的种类，采用不同的技术方法，结合并行测序、宏基因组学等获取好氧反硝化菌群体的初步结构数据，并具体分析不同反硝化菌株的反硝化机制。
总之，为了充分发挥低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选鉴定，反硝化研究者需要选用恰当的技术，结合物种和品系特性，采取合适的方法，有效地获得其反硝化机制相关信息，从而为抑制水体中氮素污染提供更多的科学依据。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
炼油废水中好氧反硝化菌的筛选及降解特性
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2016年第35卷第5期·1524·化 工 进展炼油废水中好氧反硝化菌的筛选及降解特性武文丽，颜家保，陈佩，霍晓琼，吴优，胡茜茜（武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081）摘要：为了提高炼油废水生物处理装置的反硝化性能，从武汉石化污水处理厂的活性污泥中筛选出一株好氧反硝化菌AD10，经生理生化及16S rDNA 序列分析，将其鉴定为假单胞菌属。
通过单因素实验研究了该菌的最适培养条件：以丁二酸钠为碳源，C/N=14，温度30℃，初始pH=6.0，摇床转速200r/min 。
在此条件下，ρ(NO 3−-N)= 556.81mg/L 时72h 的去除率为97.2%，且耐受的硝酸盐氮质量浓度达到654.00mg/L 。
菌株AD10培养11.5 h ，对ρ(NO 3−-N)=140.31mg/L 和ρ(TN)=141.62mg/L 的去除率分别为95.8%和93.9%，其反硝化速率高于大部分已发现的好氧反硝化菌，检测到的ρ(NO 2–-N)≤2.30mg/L ，未出现明显的积累，菌株AD10能够进行完全反硝化。
关键词：炼油废水；假单胞杆菌；好氧反硝化；硝酸盐氮；总氮中图分类号：X 172 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2016）05–1524–05 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.05.039Screening of an aerobic denitrifier from refinery wastewater and itscharacteristicsWU Wenli ，YAN Jiabao ，CHEN Pei ，HUO Xiaoqiong ，WU You ，HU Qianqian（College of Chemical Engineering and Technology ，Wuhan University of Science and Technology ，Wuhan 430081，Hubei ，China ）Abstract: In order to improve the denitrification efficiency of the bioreactor of refinery wastewater treatment plant ，an aerobic denitrifier AD10 was isolated from the activated sludge of a petrochemical wastewater treatment plant in wuhan city. It was identified as a member of the genus Pseudomonas sp. according to its morphyological and physiological properties and 16S rDNA gene sequence analysis. Through the single factor experiment investigations ，the optimum denitrification conditions were: sodium succinate as carbon source ，C/N 14，temperature 30℃，initial pH 6.0，rotation speed 200 r/min. Under these conditions ，the nitrate remove efficiency of AD10 was 97.2% when it was cultivated in 556.81 mg/L nitrate for 72h ，and it could tolerate at least 654 mg/L of nitrate nitrogen. Culturing after11.5h ，AD10 show the NO 3–-N and TN removal rate of 95.8% and 93.9%，when the concentration ofNO 3--N and TN were 140.31mg/L and 141.62mg/L ，respectively. AD10’s denitrification rate is higher than most of the aerobic denitrifying bacteria have been found. During this process ，only a very smallamount of NO 2–-N (≤2.30mg/L) was detected ，indicating a complete denitrification.Key words: refinery wastewater ；Pseudomonas sp.；aerobic denitrification ；nitrate nitrogen ；total nitrogen传统生物脱氮是由好氧硝化作用和厌氧反硝化作用共同完成的，这两个过程需在不同的反应器中分开进行，工艺耗时且运行费用高、操控复杂、能耗大[1]。
好氧反硝化细菌的分离及其反硝化能力
好氧反硝化细菌的分离及其反硝化能力
1、好氧反硝化细菌的分离：
通常可以采用碳氮源镜片分离技术，将碳氮源当作诱导剂，分离出具有反硝化能力的细菌株；也可以采用一种叫做乳杆菌抗体吸附-碳氮源镜片法的分离，使用乳杆
菌抗体把有反硝化能力的细菌吸附在培养基上，从而分离反硝化细菌。
2、反硝化能力：
反硝化细菌的反硝化能力主要体现在其以氧气为酸化剂，将硝酸还原为氨的能力。
此外，反硝化细菌还具有氧化硝酰氯为氯气和水的能力。
主要的反硝化细菌有大肠杆菌、海藻革蘭氏阳性杆菌等。
另外，反硝化细菌还具有抗逆性，可在酸碱条件范围内正常生长，并且反硝化活性能在pH 4-7范围内均保持较高水平。
另外，反硝化细菌还具有耐受高温、高盐和
高硝酸的能力，能够在污染物浓度较高的环境中维持反硝化活性，从而发挥出重要的污染物去除作用。
反硝化细菌的反硝化机制主要由多种反硝化酶参与，其中最重要的是氨氧化酶（ammonia monooxygenase，AMO），该酶能将硝酸氨转化为氨气和氧气，也可以将硝酸转化成亚硝酸根和氧气。
此外，反硝化细菌还能合成一种称为反硝化酸（nitrate reductase，NR）的酶，它能将硝酸还原成硝酸根，从而实现反硝化功能。
此外，反硝化细菌还能合成一种叫做氧化硝酰氯酶（chlorate reductase，CR）的酶，该酶能将硝酰氯转化成氯气和水，从而实现反硝化功能。
总之，好氧反硝化细菌是一种特殊的细菌，具有良好的分离及反硝化能力，可以提高水质，是净化水体中氮素污染物的重要工具。
好氧反硝化菌群的筛选及其培养条件的研究
好氧反硝化菌群的筛选及其培养条件的研究孙菲;方金武;蔡昌凤;赵文玲【摘要】从淮北焦化厂A2/O污水处理站二沉池的活性污泥中,采用焦化废水配制的牛肉膏蛋白胨固体培养基(DM100)分离纯化出7株反硝化细菌,并通过梯度添加焦化废水的平板驯化和液体驯化,在DO=2.5 mg/L的条件下复筛出4株具有抗逆性的优势好氧反硝化细菌,分别命名F4、F8、F9、F10.优势单菌株与组合菌群反硝化能力的对比试验表明,4株混合的好氧反硝化菌群生长快速稳定,在相同的试验条件下脱氮效率高于单菌株,48 h的NO-3-N去除率为98.75%.4株混合菌群的最适生长条件为:35 ℃,pH=8.0,C/N比=5,接种量=25%(菌液浓度为(2～3)×107 个/mL).经过筛选和条件优化,优势菌群NO-3-N去除率达到90%的降解时间由96 h 降到18 h.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2010(025)002【总页数】5页(P36-39,79)【关键词】好氧反硝化菌群;筛选;培养条件;焦化废水【作者】孙菲;方金武;蔡昌凤;赵文玲【作者单位】安徽工程大学,生物化学工程学院,安徽,芜湖,241000;芜湖新兴铸管有限责任公司,安徽芜湖,241002;安徽工程大学,生物化学工程学院,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,生物化学工程学院,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】X703.1由于工业废水大量排放,农业长期大量施用化肥,硝酸盐污染水源的现象日趋严重[1].硝酸盐氮可以转化成三大致癌物之一的亚硝胺,对人的健康危害很大,因此硝酸盐污染问题正日益受到国内外研究者的关注[2-4].反硝化在传统意义上被定义为某些细菌在无氧或微氧条件下以或作为电子受体进行呼吸代谢获得能量,同时将或还原为N2O或N2的过程[5].然而,近几年学者们不断地发现好氧条件下发生总氮损失[6].国内外的不少研究和报道已能充分证明,反硝化可在有氧条件下发生.好氧反硝化菌具有独特的脱氮优势:(1)好氧反硝化能与硝化在一个反应器中进行,减少占地面积和建设资金;(2)硝化的产物可直接作为反硝化作用的底物,避免硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的积累对硝化反应的抑制,加速硝化-反硝化进程;(3)反硝化释放出的OH-可部分补偿硝化反应所消耗的碱,维持系统中pH的稳定[7].有关好氧硝化-反硝化生物脱氮的研究日趋活跃[8-9].本文通过梯度法添加焦化废水的培养基筛选、驯化好氧反硝化菌,并比较单菌株和混合菌群的生长情况和反硝化能力,并研究其最适培养条件.为工业应用获得抗性较强、生长稳定、反硝化能力强、适应焦化废水处理的好氧反硝化菌群.1 材料与方法1.1 试验材料菌种来源:淮北煤焦化公司酚氰污水处理站(A2/O工艺)二沉池活性污泥.试验所用焦化废水:芜湖市新兴铸管厂焦化废水生化处理站经过气浮除油除渣的焦化废水,COD为4829.3mg/L,NH+4-N为114.85mg/L,NO-3-N为7.87mg/L,挥发酚为862mg/L,氰化物为157 mg/L,pH在9.0左右.反硝化细菌基础分离培养基(DM0):牛肉膏10g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,琼脂15～20g/L,蒸馏水,调节pH到7.4～7.6,121℃灭菌20min.同时配制以焦化废水代替蒸馏水的DM100.反硝化细菌扩大培养培养基(FM10):白糖13.2g/L,KNO32g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4◦7H2O0.2g/L,FeSO4◦7H2O0.05g/L,CaCl20.02g/L,添加体积比 10%的焦化废水,调节pH 至 7.5～8.0,115℃灭菌30min(NO-3-N质量浓度为315.47mg/L).FM60为添加60%焦化废水的反硝化细菌扩大培养基.1.2 试验方法(1)菌源活性污泥的富集.取适量的活性污泥接种到150mLFM10中,30℃、160r/min振荡培养48h后,取10mL培养液转接扩大培养3次.(2)反硝化菌的分离纯化.取0.2mL不同稀释度的菌液分别涂布在DM0和DM100上(每个稀释度3个重复),30℃下培养1～3d,比较DM0和DM100上菌落形态和生长情况,经多次划线纯化筛选出10株菌株.(3)反硝化细菌的初筛.在无菌的环境下,将上述分离纯化的菌株接种到FM10中,30℃、160r/min摇床培养48h和96h取样,测定浓度变化,比较各菌株反硝化能力检测采用酚二磺酸分光光度法.(4)反硝化细菌的驯化和复筛.平板驯化 :将初筛出的 F3、F4 、F5、F7、F8 、F9、F10逐级在 DM10、DM20、DM40、DM60、DM80、DM100上划线转接,增强菌株对焦化废水的适应性.液体驯化:将平板驯化后的菌株接种到FM10中,30℃、160r/min摇床培养24h后,每隔12h增加培养基中焦化废水的比例,同时取样测定NO-3-N浓度变化.(5)优势单菌株与组合菌群反硝化能力对比试验.把驯化复筛出的优势菌菌液以20%接种量接种到FM10中,30℃、160r/min培养24h,测定NO-3-N浓度变化.同时选出反硝化速率较快的单株优势菌进行2株和3株混合,同单菌株、4株菌株混合进行对比试验.(6)优势菌群的培养条件验证试验.分别在不同温度(20～40℃)、pH(6.5～9.0)、C/N 比(1～7)、接种量(5%～40%),确定优势菌群脱氮的最佳条件.试验项目中,除因素试验外,其他均按FM10,pH=7.5～8.0,35℃,160r/min,DO=2.5mg/L,菌液浓度为(2～3)×107个/mL进行.(7)生长曲线的绘制.细菌的生长可以使澄清的培养液逐渐变得浑浊,菌悬液中细菌的数量与其吸光度成正比,因此,测定其不同生长时期菌悬液的吸光度值,可得到细菌的生长曲线[10].本试验使用721分光度计在600nm处测培养液吸光度值,从宏观上观察菌体的增势,并不具体计算菌量.具体方法:以20%的接种量将优势好氧反硝化菌接种到120mLFM10中,35℃,160r/min摇床培养,每隔4h取样测定培养基中的吸光度值,绘制生长曲线.2 结果与分析2.1 分离纯化反硝化菌的特性划线分离得10株纯菌株,分别编号F1～F10.菌落的形态如表1所示.DM0和DM100上生长的菌落有较大差异.DM0上生长的菌株占优势的主要是F3,直径约1～2mm的边缘整齐的圆形菌落;DM100上菌落形态丰富,无明显优势菌落.表1 细菌分离纯化结果名称菌落形态革兰氏染色细菌形态 DM0 DM100 F1 淡黄色(接近白色),圆形阴性杆状有有F2 乳白色,针尖大小圆形阴性杆状有有F3 白色,1～2mm圆形,边缘整齐阳性杆状有有F4 乳白色,圆形透明,发荧光阴性球状有有F5 淡红棕色,圆形,发荧光阴性杆状有有F6 浅黄色,圆形阳性杆状有有F7 橘黄色,圆形阳性球状有有F8 白色,发绿色荧光,圆形阳性球状无有F9 白色边缘透明,圆形,边缘不整齐阴性球状无有F10 淡黄色(接近白色),圆形阳性杆状有有2.2 好氧反硝化菌的驯化和筛选结果(1)初筛结果.取DM100分离纯化所得菌株进行初筛,其中F7和F8分离纯化时在DM0无生长,疑是杂菌,取两株混合验证.从各菌株降解NO3-N的结果(见图1)可明显看出,F6的NO-3-N降解能力很低,最高仅为4.16%.F1、F2由48h培养至96h,培养基中NO-3-N浓度反而升高,说明菌体衰退死亡,蛋白质降解产生了NO-3-N.F7+F896hNO-3-N去除率可达到98.71%,所以初步认为96hNO-3-N去除率在 97%以上的 F3、F4 、F5 、F7 、F8、F9、F10为优势菌.(2)驯化复筛结果.由表2所示,在相同的实验条件下,驯化复筛时逐渐增大焦化废水的比例使菌株NO-3-N降解情况与初筛时相差很大,说明焦化废水中的有毒有害物质会影响限制好氧反硝化菌的生长.在焦化废水比例达60%条件下,72h,F3、F5、F7在 FM60中NO-3-N 去除率在 50%以下,F4、F8、F9、F10可达到68.95%～71.48%,说明F4、F8、F9、F10的抗逆性均较好,为本次试验的目的菌株.表2 驯化和复筛时菌株NO-3-N降解情况时间/h 焦化废水体积比/%NO-3-N去除率/%F3 F4 F5 F7 F8 F9 F10 24 10 0.88 6.64 0.35 1.61 3.58 8.46 2.77 48 35 20.30 35.14 21.90 20.28 34.00 37.00 42.67 72 60 47.76 68.95 43.23 36.68 71.00 68.55 71.482.3 优势单菌株与组合菌群反硝化能力对比试验结果焦化废水成分复杂,有毒有害难降解污染物含量高,工艺上一般选用混合菌群进行生物降解,以弥补单株菌株抗逆性差的缺点.本次试验比较单菌株与组合菌群的生长情况和反硝化能力,以筛选培育出优势降解菌.由图2可知,F4、F10和F4z的启动速度快、菌量增值迅速,OD值变化量大于1.2.图3表明复筛出的4株菌去除率都可达到90%以上,只是启动的速度不同:F4、F10、F2z、F3z、F4z48h的去除率达到90%以上,而F9、F8分别在72h和96h才能达到.且去除率和菌量增值最大,分别为98.75%和1.78.说明4株混合菌群中各菌落不存在竞争抑制,同时各菌株间不同的启动速度能增强其工艺应用时的稳定性.图1 初筛时菌株NO3--N降解情况图2 单菌株与组合菌群菌量变化情况图3 单菌株与组合菌群NO3--N降解情况2.4 优势菌群的培养条件验证试验(1)优势菌群的最适生长温度.废水生物处理中的反应温度,与微生物的生长、繁殖关系密切,温度支配着酶反应力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等,因而对污染物的降解转化起着关键的作用[11].本实验考察了反硝化混合菌群在20～40℃范围内的反硝化能力.不同温度下优势菌群降解和菌量变化情况如图4所示.由图4可看出,反硝化菌群从20～35℃的温度范围内菌量和反硝化的能力随温度升高而提高,温度达到40℃时菌群生长缓慢,反硝化能力下降,可能是由于温度过高,蛋白质凝固,酶的作用受到破坏.其中反硝化菌群的最适生长温度在35℃左右,其菌量的增长最快,去除率最高,达到67.67%.(2)优势菌群的最适pH值.微生物的生命活动、物质代谢与pH密切相关,在最适pH范围内酶活性最高,如果其他条件适合,微生物的生长速率也最快.不同pH条件下优势菌群降解和菌量变化情况如图5所示.本试验所研究的优势好氧反硝化菌群最适pH为8.0,此时去除率可达到99.43%.当pH达8.5以上时,菌群的生长受到抑制,反硝化的能力急速下降.试验表明,好氧反硝化菌群适合在偏碱性的环境下生长,pH过低或过高时,可能使酶的活性下降,从而抑制其生长,甚至丧失活力.(3)优势菌群的最适C/N比.好氧反硝化菌一般为异养菌,若碳源不足会脱氮不充分,焦化废水含有的有机物难降解不易被微生物利用,需要投加外来碳源.实验中使用易于生物降解、廉价易得,适合工业应用的白糖作为碳源进行研究.由图6可以看出,好氧反硝化菌群最适C/N比为去除率为92.33%,当C/N比小于5时,反硝化的能力和菌量随着C/N比的增大而增加,C/N比大于5时,N去除率基本不变,菌量增势趋于稳定.(4)优势菌群的最佳接种量.接种量影响反硝化作用的启动速度,不同接种量的去除效果和菌量的变化(见图7).接种量为5%～20%时,菌群菌量和反硝化能力随着接种量的增加而增大.当接种量为25%时,18hNO-3-N的去除率达到89.54%,继续增加接种量,反硝化的能力趋于稳定,但OD值变化量下降,说明此时菌群之间的竞争作用影响菌量的增值.图4 温度对优势菌群生长的影响图5 pH对优势菌群生长的影响图6 C/N比对优势菌群生长的影响图7 接种量对优势菌群生长的影响2.5 生长曲线的绘制测定细菌生长曲线了解其生长繁殖规律,这对有效地利用和控制菌的生长具有重要的意义.细菌接种到均匀介质的液体培养基后,细菌生长曲线表现出4个不同的生长时期:迟缓期、对数生长期、稳定生长期、衰亡期[12].由图 8可以看出,单株优势菌除F4能够在41h进入稳定期,且稳定期长外,其余3株菌的迟缓期和对数期长,稳定期较短.4株混合反硝化菌群菌液浓度的峰值虽低于单株菌株,但迟缓期最短,最先进入稳定期,且稳定期时间长.说明4株混合反硝化菌群适合工艺上的应用,反硝化能力稳定.图8 优势好氧反硝化菌的生长曲线3 结论采用DM100分离纯化、并通过平板驯化和液体梯度驯化复筛方法,有利于保持目的菌株对焦化废水的抗逆性.筛选出的四株好氧反硝化菌的混合菌群不存在竞争抑制.混合菌群相比单菌株启动速度和菌量增值加快,降解效率最高,反硝化能力稳定,有利于工艺上的应用.通过实验得出,优势好氧反硝化菌群最适发酵温度为35℃,pH为8.0,C/N比为5,接种量为25%(菌液浓度为(2～3)×107个/mL).经过条件优化,菌群去除率达到90%的降解时间由96h降到18h.参考文献:[1] 李树刚,马光庭.生物脱氮菌种筛选及条件选择的研究[J].广西大学学报,2003,28(2):173-176.[2] 吕忠贵,杨圆.浅析氮磷化肥的使用利用及对农业生态环境的污染[J].农业环境与发展,1997,14(3):30-34.[3] 陈建耀,王亚,张洪波,等.地下水硝酸盐污染研究综述[J].地理科学进展,2006,25(1):34-44.[4]ZhangM,TayJH,QianYetal.CokePlantWastewaterTreatmentbyFixedBiofilmSy stemforCODandNH3-N Removal[J].WatRes,1998,32(2):519-527.[5] 孙建光,高俊莲,马晓彤,等.反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展[J].中国土壤与肥料,2007(2):7-12.[6] 周丹丹,马放,王宏宇,等.关于好氧反硝化菌筛选方法的研究[J].微生物学报,2004,44(6):837-849.[7] 项慕飞,汪苹,李秀婷,等.废水脱氮系统中好氧反硝化菌的筛选与鉴定[J].食品科技,2006(7):153-155.[8]XieSG,ZhangXJ,WangZS.IntegratedstudyonbiochemicalMechanisminbiofilte rsystem[J].ActaSciCircumst,2002,22(5):557-561.[9]DingAZ,FuJM,ShengGY.Evidenceofaerobicdenitrification[J].ChinScieBull,200 0,45(3):2779-2782.[10]李永勇,罗泽娇,毛绪美,等.好氧反硝化细菌的筛选及反硝化效率测定[J].安徽农业科学,2008,36(6):2191-2193.[11]李树刚,马光庭.生物脱氮菌种筛选及条件选择的研究[J].广西大学学报(自然科学版),2003,28(2):173-176.[12]俞毓馨,吴国庆,孟宪庭.环境工程微生物手册[M].北京:中国环境科学出版社,1990.。
一株好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及紫外诱变
一株好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及紫外诱变邵颖;陈安徽;董玉玮【摘要】从牛蒡(Arctium lappa L.)根际土壤中分离到1株具有较高反硝化能力的好氧细菌YB000,对该菌株采用生理生化及分子生物学方法进行了鉴定,并且对该菌株进行了以提高反硝化性能为目的的紫外诱变.结果表明,分离自牛蒡根际的反硝化细菌经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),该菌株于距离30W紫外灯30 cm处照射240 s可获得具有较强脱氮能力且遗传性状稳定的诱变菌株YB004和YB005,其脱氮能力分别达到93.43％、92.03％.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2016(000)013【总页数】5页(P3305-3309)【关键词】好氧反硝化细菌;牛蒡(Arctium lappa L.);根际土壤;筛选;鉴定;紫外诱变【作者】邵颖;陈安徽;董玉玮【作者单位】徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008;徐州工程学院食品(生物)工程学院,江苏徐州221008【正文语种】中文【中图分类】X172随着水产养殖业的迅猛发展、含氮工业废水的排放及农业中化肥的过量施用，导致水体氮素含量严重超标而影响水体的使用安全［1，2］。
氮素超标是导致水体富营养化的重要原因之一，生物脱氮可有效去除水体中的氮元素［3］。
传统的生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程，反硝化脱氮能将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮转化为气态氮，从根本上解决水体中氮素超标的问题。
反硝化细菌是能够引起反硝化作用的细菌，多为异养、兼性厌氧细菌［4］，但近期研究表明，一些微生物在较高的氧分压条件下也能表现出反硝化能力［5-8］。
好氧反硝化作用实现了硝化和反硝化作用的同时进行，不仅简化了生物脱氮流程、降低了投资成分，而且还表现出了传统废水处理方法所无法比拟的优势，如硝化过程无需加碱中和、脱氮效率高、对氨态氮耐受能力强等［9］。
杞麓湖底泥好氧反硝化菌的筛选及反硝化特性研究
泊 面 积 ３ ． ｍ ，湖 容 积 １７亿 Ｉ ５ ９ｋ ． ｎ ，无 明显 出流 口 ，为 一 封 闭 型 高 原 湖 杞 麓 湖 流 域 是 自。
通 海 县 社 会 经 济 发 展 的 主 体 ，是 通 海 县 生 存 发 展 的 基 础 ，通 海 人 民把 杞 麓 湖 称 为 “ 亲 母 湖” 。湖 泊 泄 水 唯 一 通 道 为 天 然 溶 洞 ，杞 麓 湖 属 富 营 养 型 湖 白，水 质 污 染 以 有 机 污 染 和 氮 、
楚 雄 师 范 学 院 学 报
２ ２ 年 第 ６ 期 ０１
１ 实 验 材 料 及 方 法 １ １ 底 泥 采集 ． 我 们选 取来 自杞 麓 湖 的 东 、南 、西 、北 岸 ，受 到 不 同污 染 源 污 染 的 底 泥 进 行 实 验 。杞
Ｄ 培 养 基 培 养 ３天后 的 溶 液测 定其 Ｔ Ｍ Ｎ、ＮＯ 一Ｎ、ＮＯ 一Ｎ 浓 度 变 化 。 最 终 成 功 分 离 得 到 一 株 编 号
为 ８ 菌 株对 Ｎ 一Ｎ的 降 解 率 ９ ． ０ ，亚 硝 态 氮 累 积 量 仅 为 ０ ６ ＃ Ｏ １７ ％ ． １ ｍｇ・Ｌ。。 该 菌 株 反 硝 化 能 力 较 。 强 ，在 实 际 的废 水 处 理 中具 有 一 定 的应 用 价 值 。 关键 词 ：底 泥 ；好 氧反 硝 化 细 菌 ；脱 氮 中 图 分 类 号 ：Ｘ ０ 文 章 标 识 码 ：Ａ ７３ 文章 编 号 ：１ ７ — ７ ０ （ ０ ２ ０ — ０ ５ — ０ ６１ ４６ ２１） ６ ０３ ５
中通 常 不是 优 势 菌 ， 且 反 硝 化 能 力 存 在 差 异 ，从 不 同环 境 中获 得 高效 的 功 能 菌 株 是 很 有 意 并
义 的 工作 。
高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件、脱氨氮特性的优化
高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件、脱氨氮特性的优化邵基伦1, 曹刚1 , 邹海明2 (1.暨南大学环境学院,广东广州510630；2.安徽科技学院,安徽蚌埠233000)摘要：为了选择和研究一种好氧反硝化细菌，从我校师琴湖水中定向筛选好氧反硝化细菌, 对分离得到的菌株进行初步鉴定, 并研究了不同碳源、碳氮比、初始pH、接种量、转数以及温度等对其反硝化特性的影响。
结果表明, 从初筛得到的35株具有反硝化活性的细菌中复筛得到一株具有较强反硝化能力的菌株ADB(Aerobic Denitrification Bacteria),该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
在以乙醇为碳源、碳氮比15 :1, 接种量1%, 初始pH 7.5, 转数160 r/min 和温度30℃的条件下, 脱氮效率最强, 对模拟污水中硝酸盐氮和总氮的去除率分别为99.19%和53.83%。
同时该菌去除氨氮过程中也能降低化学需氧量（COD），并且不积累硝酸盐和亚硝酸盐．不同碳源种类下该菌株的脱氨氮能力从高到低顺序为：丁二酸钠、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸三钠．除氨氮和COD的最适初始为pH7.5，最适温度为30℃．该菌株在最适条件下，24ｈ对氨氮的降解率可以达到100％，48ｈ对COD的降解率为73.44％．关键词：好氧反硝化；异养硝化；定向筛选; 反硝化特性; 假单胞菌属；氨氮中图分类号：文献标识码：A文章编号：Screening and identification of aerobic denitrifiers and the optimization of denitrification conditions and taking of the ammonia nitrogen characteristics Abstract: Aerobic denitrifying bacteria were isolated directly from the aquaculture water of Shiqing lake in our school. Following characterizing the phylogeny of the strains with the highest denitrifying capability, the effects of carbon source, C/ N ratio, initial pH, inoculation quantity, rotational speed and temperature on the characteristics of denitrification were studied. The results showed that 35 strains of aerobic denitrifiers were obtained by primary screening on plates of Bromothymol Blue medium. One strain named ADB, which had the highest denitrifying capability was identified after secondary screening and was designated as Pseudomonas sp. Furthermore , the optimum conditions for denitrification were as follows: carbon sources ethanol, C/ N ratio 15:1,inoculation quantity 1%, initial pH 7.5, rotational speed 160 r/min, and temperature 30℃. Under such condition, the removal rate of nitrate nitrogen and total nitrogen in simulation sewage were 99.19% and 53.83%, respectively. At the same time the bacteria in the process of removing ammonia nitrogen can also reduce chemical oxygen demand (COD),and not accumulation of nitrate and nitrite. Different carbon source type the strains to take off the ammonia nitrogen ability from high to low order: succinic acid sodium, acetic acid sodium, sucrose, glucose, citric acid three sodium. Except the ammonia nitrogen and the optimal initial COD for PH7.5,the temperature for 30℃.The strains in the optimal condition,24h of ammonia nitrogen degradation rate of up to 100%,48h of the degradation of COD rate was 73.44%.Key words: aerobic denitrification; anaerobic nitrification;screening; denitrifying characteristics; Pseudomonas sp.; ammonia nitrogen1. 引言据统计，我国环境总体形势依然十分严峻．湖泊（水库）富营养化问题依然突出，在监测营养状态的26个湖泊（水库）中，富营养化状态的占42.3％．水体的富营养化问题主要由水体中的总氮超标所引起．由于氮元素污染的危害，脱氮已经成为水处理和防止氮素危害的重要一步．因此，生物脱氮是水处理中防止氮素危害最经济有效的方法之一．传统生物脱氮理论认为：氨氮的去除是通过硝化和反硝化两个相互独立的过程实现的，由于对环境条件的要求不同，这两个过程不能同时发生，而只能序列式进行，即硝化反应发生在好氧条件下，反硝化反应则发生在严格的缺氧或厌氧条件下。
好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性
第23卷 第1期2010年1月环 境 科 学 研 究Research of Envir on mental Sciences Vol .23,No .1Jan .,2010好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性安 健,宋增福,杨先乐3,黄志华,张小能上海海洋大学水产与生命学院,国家水生动物病原库,上海 201306摘要:从对虾养殖池塘中筛选出多株具有好氧反硝化性能的芽孢杆菌,其中芽孢杆菌YX -6能够在14h 内将ρ(亚硝酸盐氮)由10mg ΠL 降至0;ρ(DO )为512～518mg ΠL 时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率接近100%.试验选取具有降氮功能的芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究了芽孢杆菌YX -6在不同pH,温度,ρ(亚硝酸盐氮)和盐度时的好氧反硝化性能.结果表明,芽孢杆菌YX -6的好氧反硝化性能显著高于阳性对照菌(P <0105).通过对芽孢杆菌YX -6的形态学观察、生理生化及16S r DNA 分子鉴定,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌(B acillus coagulans ).关键词:好氧反硝化;芽孢杆菌;亚硝酸盐中图分类号:X17 文献标志码:A 文章编号:1001-6929(2010)01-0100-06S c reen i ng o f Ae ro b i c D en itri fyi ng B ac ill u s and S tudy o n D en itri fi ca ti o n C ha rac te ris ti c sAN J ian,S ONG Zeng 2fu,Y ANG Xian 2le,HUANG Zhi 2hua,Z HANG Xiao 2nengState Collecti on Center of Aquatic Pathogen,College of Fisheries and L ife Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,ChinaAbstract:Many B acillus strains with aer obic denitrificati on character were is olated fr om the water and sedi m ent of shri m p culture ponds .Among the m,the B acillus YX 26could degrade nitrite nitr ogen fr om 10mg ΠL t o zer o in 14h,as well as app r oxi m ately 100%of nitrite nitr ogen removal rate at a DO mass concentrati on of 5122518mg ΠL 1Further more,in comparis on with the denitrifying B acillus selected as the positive contr ol,the denitrificati on characteristics of B acillus YX 26were tested under different pH,te mperature,nitrite concentrati on and salinity .The results showed that the aer obic denitrificati on characteristics of B acillus YX 26were significantly higher than those of the positive contr ol (P <0105).According t o mor phol ogical observati on,physi ol ogical and bi oche m ical p r operties,and 16S r DNA molecular identificati on,the B acillus YX 26was identified p ri m arily as B acillus coagulans .Key words:aer obic denitrificati on;B acillus ;nitrite收稿日期:2009-06-08 修订日期:2009-08-20基金项目:国家公益性行业科研专项(nyhyzx072042);现代农业产业技术体系建设专项资金项目(nycyts -49-17)作者简介:安健(1983-),男,内蒙古呼和浩特人,anjian520@s ohu .com.3责任作者,杨先乐(1948-),男,湖南桃源人,教授,博导,主要从事水产动物免疫、鱼类药理学与渔药的检测与监控、水产动物疾病控制的理论与技术研究,xlyang@shou .edu .cn 自20世纪80年代ROBERTS ON 等[1]首次分离出好氧反硝化细菌〔Th iosphaera pantotropha ,现更名为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans )〕以来,好氧反硝化细菌的分离及其反硝化性能的研究与应用得到了迅速发展,目前已发现多个属的细菌具有好氧反硝化功能,如M icrovirgula aerodenitrificans [225],副球菌属(Paracoccus s p.)[6],假单胞菌属(Pseudo m onas s p.)[7210]和产碱杆菌属(A lcaligeness p.)[11212]等.好氧反硝化细菌最重要的特点是能够在有氧环境中发挥反硝化作用,将NO 3-或NO 2-还原为N 2[1].好氧反硝化细菌的发现与研究,拓宽了人们对微生物反硝化现象的认识,为有氧条件下氮素的去除开辟了新的途径.水产养殖中,过量的亚硝酸盐氮对水生动物具有相当的毒害作用,并有可能进一步诱发细菌病、病毒病等病害,给水产养殖业造成巨大的经济损失.每年类似的报道屡见不鲜,在夏季高温季节,这种情况更为突出[13214].因此,养殖水体亚硝酸盐氮的有效去除是水产业亟待解决的问题之一.在目前高密度集约化养殖模式下,氧气的充足供给是保证健康水产养殖的必要条件;而传统反硝化细菌多为厌氧菌,有氧条件下其对亚硝酸盐氮的降解性能必定受到一定的抑制,这毫无疑问地将造成现有生产模式与传统降解亚硝酸盐氮方法之间第1期安 健等:好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性的矛盾,好氧反硝化细菌恰恰为解决该矛盾提供了思路和出路.芽孢杆菌作为益生功能菌已得到广泛应用,目前虽有一些关于芽孢杆菌降解亚硝酸盐氮作用的报道[15216],但大都停留在试验研究阶段;同时,由于养殖水体环境的复杂多变与菌种降氮稳定性不足等因素的影响,即使有所应用,效果也并不理想.因此,笔者从生产实际出发,筛选能适应复杂养殖水体环境、降解亚硝酸盐氮性能稳定的优质芽孢杆菌,进而有效地解决养殖水体有氧条件下亚硝酸盐氮的积累问题,以期为水产动物的健康养殖提供技术支持.1 材料与方法111 材料11111 样品试验所用样品采集于高密度对虾养殖池水与池塘底泥.11112 对照菌种阳性对照菌选用有降氮功能的枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)BYK00318-01-01和蜡样芽孢杆菌(B acillus cereus)BYK00045-01-01(由国家水生动物病原库提供).11113 培养基LB液体培养基:蛋白胨10gΠL,牛肉膏5gΠL, NaCl5gΠL,pH710.LB固体培养基:在LB液体培养基中添加琼脂15～20gΠL.LB高盐培养基:在LB液体培养基中将NaCl的量增至30gΠL.BT B培养基[17]:天冬酰胺酸1gΠL,K NO31gΠL, KH2P O41gΠL,FeCl2・6H2O0105gΠL,CaCl2・2H2O 012gΠL,MgS O4・7H2O1gΠL,BT B1gΠL,琼脂20 gΠL,pH710～712.反硝化培养基(测定性能):琥珀酸钠4172gΠL, Na NO20105gΠL,KH2P O4115gΠL,Na2HP O40142 gΠL,MgS O4・7H2O1gΠL,pH712.所有培养基经0111MPa,121℃,灭菌20m in. 112 方法11211 好氧反硝化芽孢杆菌的筛选1121111 耐盐芽孢杆菌的筛选将采集的水样与泥样先在LB液体培养基(NaCl5gΠL)中培养18～24h后,于75～80℃水浴锅中处理10～15m in,再将培养物在LB高盐培养基(NaCl30gΠL)固体平板中进行稀释涂布,选取生长良好的单个、不规则、表面粗糙的菌落反复划线分离进行纯培养.1121112 好氧反硝化芽孢杆菌的初筛及复筛将筛选出的耐盐芽孢杆菌稀释涂布在BT B显色平板上,30℃下培养1～2d,挑选出能够使BT B 平板变成蓝色的菌种为目的初筛菌.将初筛菌种活化后按1%(体积比)的量接入100mL反硝化培养基中,30℃,200rΠm in下摇瓶培养24h,测定溶液中的ρ(亚硝酸盐氮),选择亚硝酸盐氮去除量较多的菌株为复筛菌.11212 好氧条件下芽孢杆菌的反硝化性能1121211 细菌生长与好氧反硝化性能的测定试验菌株经纯培养18h后按1%(体积比)的添加量接种到200mL的反硝化培养基中,30℃, 200rΠm in下摇床振荡培养,每隔2h取样1次,每次取样10mL,先测定细菌光密度A600,然后经8000 rΠm in离心,取上清液测定培养液中的ρ(亚硝酸盐氮).1121212 溶解氧与菌体反硝化性能的测定试验菌株经纯培养18h后,按1%(体积比)的添加量接种到100mL反硝化培养基中,通过摇床控制转速分别为0,100,150,200,250和300rΠm in,培养24h后测定培养液中的ρ(亚硝酸盐氮)和ρ(DO).1121213 不同pH下细菌对亚硝酸盐氮的降解试验菌株经纯培养18h后按1%(体积比)的添加量接种到pH分别为3,5,7,9和11的100mL 反硝化培养基中,30℃,200rΠm in下摇床振荡培养24h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同pH下的反硝化性能.1121214 不同温度下细菌对亚硝酸盐氮的降解试验菌株经纯培养18h后按1%(体积比)的添加量接种到100mL反硝化培养基中,分别在10, 15,20,25,30,35和40℃下经200rΠm in摇床振荡培养24h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同温度条件下的反硝化性能.1121215 不同ρ(亚硝酸盐氮)对细菌好氧反硝化性能的影响试验菌株经纯培养18h后,按1%(体积比)的添加量分别接种到初始ρ(亚硝酸盐氮)为20,40,101环 境 科 学 研 究第23卷60,80和100mgΠL的100mL亚硝酸盐氮反硝化培养基中,30℃,200rΠm in下摇床振荡培养24h后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同ρ(亚硝酸盐氮)下的反硝化性能.1121216 不同盐度下细菌对亚硝酸盐氮的降解配制盐度分别为5,10,15,20,25和30的人工海水并添加反硝化培养基,将纯培养18h后的菌株按1%(体积比)的添加量分别接种到100mL反硝化培养基中,30℃,200rΠm in下摇床振荡培养24h 后,测定ρ(亚硝酸盐氮);同时,以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌作为阳性对照菌,比较研究试验菌株在不同盐度下的反硝化性能.11213 分析方法ρ(亚硝酸盐氮)的测定采用N-1-萘-乙二胺比色法[18];A600的测定采用紫外分光光度法;ρ(DO)的测定采用碘量法(G B7489—87).11214 试验结果的统计分析试验结果用平均值±标准方差(n=3)表示,运用SPSS11110软件,经One-W ay ANOVA分析,采用Duncan’s多重检验分析试验结果平均值的差异显著性,设差异水平α=0105(P<0105为差异显著).2 结果与分析211 好氧反硝化芽孢杆菌筛选对采集水样与泥样进行菌种分离,初步筛选出18株细菌,通过形态及染色观察后发现这18株细菌均为革兰氏阳性菌,产芽孢.将这些细菌通过BT B 培养基初筛,从中筛选出8株能够使BT B平板变色的细菌,对这8株细菌的好氧反硝化性能进行比较研究,最终筛选出一株能够高效降解亚硝酸盐氮的菌株,该菌对亚硝酸盐氮的去除率可达100%,经生理生化及16S r DNA分子鉴定,该菌与凝结芽孢杆菌的亲缘关系最近,同源性达98%,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌(B acillus coagulans)(数据另有文章报道),试验中以芽孢杆菌YX-6命名.212 好氧条件下芽孢杆菌的反硝化性能21211 细菌生长与好氧反硝化性能的测定如图1所示,随着细菌的生长,4h后芽孢杆菌YX-6得以迅速增殖,该阶段为细菌的对数生长期;同时,芽孢杆菌YX-6能够在14h内将初始量为10mgΠL的亚硝酸盐氮降解为0,去除率达100%. 21212 ρ(DO)对细菌反硝化性能的影响图1 芽孢杆菌Y X-6生长与亚硝酸盐氮的降解曲线Fig.1 Dyna m ics of B acillus YX26gr owth anddegradati on curves of nitrite nitr ogen如图2所示,随着摇床转速的增大,反硝化培养基中的ρ(DO)不断增高.芽孢杆菌YX-6对亚硝酸盐氮的去除率也随着ρ(DO)的增高而增大,但当ρ(DO)超过518mgΠL时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率逐渐降低.图2 ρ(DO)对芽孢杆菌Y X-6降解亚硝酸盐氮的影响Fig.2 Effects of DO mass concentrati on on thenitrite nitr ogen degradati on of B acillus YX2621213 pH对细菌降解亚硝酸盐氮的影响如图3所示,3种菌的反硝化活性均能在pH为7时达到最大,而芽孢杆菌YX-6能够在pH为5～9的范围内对亚硝酸盐氮的去除率保持近100%. pH为3时,芽孢杆菌YX-6对亚硝酸盐氮的去除率可达80%,pH为11时其仍具有一定的反硝化活性;而2株阳性对照菌在pH为3和9～11的范围内的反硝化活性则相对较低.21214 温度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响如图4所示,随着温度的升高,3株菌的反硝化活性不断增加,当温度为30℃时,3株菌的反硝化活性均达到最大,对亚硝酸盐氮的去除率接近100%.随着温度的继续升高,3株菌的去除率有明显下降的趋势,相比2株阳性对照菌,芽孢杆菌YX-6能够在25～40℃的范围内始终保持较高的反硝化活性,在40℃的高温下其对亚硝酸盐氮的去除率仍可达90%以上.201第1期安 健等:好氧反硝化芽孢杆菌筛选及其反硝化特性图3 pH 对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig .3 Effects of pH on the nitrite nitr ogendegradati on ofstrains图4 温度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig .4 Effects of te mperature on the nitrite nitr ogendegradati on of strains21215 ρ(亚硝酸盐氮)对细菌反硝化性能的影响如图5所示,当ρ(亚硝酸盐氮)为20mg ΠL 时,芽孢杆菌YX -6和枯草芽孢杆菌均可保持较高的反硝化活性,其对亚硝酸盐氮的去除率接近100%.随着初始ρ(亚硝酸盐氮)的增高,3株菌的反硝化性能逐渐降低.当ρ(亚硝酸盐氮)为100mg ΠL 时,芽孢杆菌YX -6对亚硝酸盐氮仍有近20%的去除率.图5 ρ(亚硝酸盐氮)对细菌反硝化性能的影响Fig .5 Effects of nitrite mass concentrati on on the nitrite nitr ogen degradati on of strains21216 盐度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响如图6所示,当盐度为5～15时,3株菌始终保持较高的反硝化活性,随着盐度继续增高,3株菌对亚硝酸盐氮的去除率逐渐降低,其中芽孢杆菌YX -6和蜡样芽孢杆菌的去除率相对较高.在盐度为30的高盐度水环境中,蜡样芽孢杆菌对亚硝酸盐氮的去除率几乎为0,而芽孢杆菌YX -6仍有近30%的去除率.图6 盐度对细菌降解亚硝酸盐氮的影响Fig .6 Effects of salinity on the nitritenitr ogen degradati on of strains3 讨论好氧反硝化细菌在自然界中广泛存在,现已有多种分离方法能够有效地筛选出好氧反硝化细菌[19220].目前已分离出较多种类的好氧反硝化细菌,但多数菌种为阴性菌[1212],带有潜在的致病性;同时,部分菌种对水体中溶解氧的耐受性较差,反硝化效率偏低[21223].因而,当前所分离出的菌种不适合高密度水产养殖的亚硝酸盐的降解应用,筛选适合水产养殖应用的好氧反硝化细菌优良菌种及其快速筛选方法的研究已显得尤为必要.笔者在该试验条件下,通过对好氧反硝化芽孢杆菌的筛选,先分离出有一定耐盐特性的益生芽孢杆菌,再对具有好氧反硝化性能的芽孢杆菌进行初筛及复筛,最终筛选出一株高性能的好氧反硝化芽孢杆菌YX -6,该菌能够在14h 内将10mg ΠL 的亚硝酸盐氮降解为0,去除率达100%.ρ(DO )对细菌的反硝化性能至关重要.P AT URE AU 等[2,24]认为,反硝化还原酶系和有氧呼吸系统同时存在于好氧反硝化细菌中,缺少NO x -或O 2都会降低细菌的生长率和反硝化效率.HUANG 等[25]研究指出,溶解氧是细菌进行好氧反硝化的关键因素,当ρ(DO )为2～6mg ΠL 时,最适于细菌生长及反硝化性能的发挥.该研究表明,随着ρ(DO )的增加,芽孢杆菌YX -6的反硝化性能不断提高,在ρ(DO )为512～518mg ΠL 时该菌的反硝化活性最高,其对亚硝酸盐氮的去除率接近100%,可见该菌的反硝化活性与ρ(DO )密切相关;但当ρ(DO )超过518mg ΠL 时,该菌对亚硝酸盐氮的去除率明显301环 境 科 学 研 究第23卷下降.这与于爱茸等[16]的研究结果相左,同时也很难用阈值理论来解释,可见不同菌种的好氧反硝化机制存在较大差异,需作进一步研究.研究表明,反硝化作用主要发生在细菌的对数生长期,该阶段随着菌体的快速增殖,水体中硝态氮、亚硝态氮的量迅速下降[26],这与马放等[27]的研究结果相符.pH对细菌反硝化作用的发挥有较大影响,pH过高或过低均会抑制反硝化还原酶的活性.G UPT A等[28229]的研究表明,细菌反硝化还原酶的最适pH是中性或微碱性,当环境pH偏离该最适范围时,细菌的反硝化活性会相应降低.该研究发现,芽孢杆菌YX-6对环境pH的变化显示出了较强的适应能力,其能够在pH为3～11的范围内保持较高的反硝化活性;在pH为5～9的范围内,该菌对亚硝酸盐氮的去除率保持接近100%,显著高于阳性对照菌.这远比文献[16,30]中报道的好氧反硝化细菌pH适应范围要广,可能是由于该菌株的反硝化还原酶对pH耐受性较强等原因所致.温度是影响反硝化还原酶活性的一个重要因素,反硝化作用最适温度范围为25～35℃,温度过高或过低,均会抑制反硝化还原酶的活性[31].该研究表明,芽孢杆菌YX-6的反硝化最适温度也在该温度范围内.在25～40℃范围内芽孢杆菌YX-6对亚硝酸盐氮的去除率可达90%以上,而阳性对照菌在40℃高温下的反硝化活性几乎丧失.这可能与芽孢杆菌YX-6的反硝化还原酶耐热机能有关,需进一步对其反硝化还原酶基因的耐热特性进行研究.由此表明,芽孢杆菌YX-6的反硝化还原酶热稳定性更好,更适合用于高水温环境的降氮应用.养殖水体亚硝酸盐的过度积累,不仅会对水生动物产生毒害作用,而且一定浓度的亚硝酸盐还会抑制菌体的反硝化活性,而有关亚硝酸盐对细菌反硝化活性影响的研究鲜见报道.该研究表明,芽孢杆菌YX-6在高浓度的亚硝酸盐环境下仍可保持较高的去除率,其对亚硝酸盐毒性的耐受性显著强于阳性对照菌,当ρ(亚硝酸盐氮)超过20mgΠL时会对菌体反硝化还原酶活性产生抑制作用,可见20 mgΠL的ρ(亚硝酸盐氮)是抑制细菌反硝化活性的一个临界值.这与于爱茸等[16]的研究结果相近,可见亚硝酸盐对菌体反硝化还原酶的基因表达具有一定的影响.自然界嗜盐细菌主要包括古细菌中的Haloarcu la,Halobacterium,Haloferax及细菌中的Halo m onas和B acillus等属的某些种[32].Y OSH I E 等[33]研究指出,盐度对菌体反硝化还原酶活性有一定的抑制作用.有关芽孢杆菌反硝化活性与盐度的相关研究国内鲜见报道.该研究表明,在盐度为0～30的范围内,芽孢杆菌YX-6对亚硝酸盐氮均可保持较高的去除率;盐度为30时,其对亚硝酸盐氮仍然可保持近30%的去除率.这可能与芽孢杆菌的耐盐机制及菌种的分离环境有关,该特性使得芽孢杆菌YX-6在海水养殖降氮及淡水养殖降氮等方面的应用存有较大优势.目前有关芽孢杆菌属的菌种,如蜡样芽孢杆菌(B acillus cereus)、枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B acillus lichenifor m),均有文献报道[15,34]其具有好氧反硝化性能.该研究筛选出的芽孢杆菌YX-6经生理生化及16S r DNA测序分析,初步鉴定其为凝结芽孢杆菌(B acillus coagu lans).笔者对凝结芽孢杆菌的好氧反硝化性能及其与养殖水体环境因子的相互影响作了较为充分的研究,但有关该菌的好氧反硝化特性及反应机制仍需作进一步研究.参考文献(References):[1] ROBERTS ON L A,K UENEN J G.Aer obic denitrificati on:acontr oversy revived[J].A rchives ofM icr obi ol ogy,1984,139(4):3512354.[2] P AT URE AU D,BERNET N.Effect of diss olved oxygen andcarborr nitr ogen l oads on denitrificati on by an aer obic cons ortium[J].App lM icr obi ol B i otechnol,2000,54(4):5352542.[3] P AT URE AU D,G ODON J J,DABER t P,et al.M icrovirgulaaerodenitrificans gen.s p.nov.,a ne w Gra m2negative bacteriumexhibiting co2res p irati on of oxygen and nitr ogen oxides up t 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水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定邵基伦环境工程专业摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。
水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。
所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。
污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。
硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。
硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。
硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。
硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。
硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。
由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。
它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。
硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。
因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。
氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。
对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。
大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。
当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。
一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。
水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。
另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。
好氧反硝化细菌的鉴定及其脱氮特性研究
好氧反硝化细菌是一类能够将氮化物(如硝酸盐)转化为氮气(N2)的细菌。
这些细菌通常存在于河流、湖泊和其他水体中,可以起到净化水质的作用。
鉴定好氧反硝化细菌的方法有很多,其中常用的方法包括:
分离纯化: 将好氧反硝化细菌从其他细菌中分离出来,并在培养基上纯化。
形态学鉴定: 对纯化后的好氧反硝化细菌进行形态学观察,包括细菌的大小、形状、生长特性等。
基因鉴定: 利用分子生物学技术,如聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR(qPCR)和测序等,对好氧反硝化细菌的基因进行鉴定。
活性鉴定: 在特定的条件下(如有氧、无氧、高温等)进行活性测试,看看细菌是否能够进行反硝化反应。
对于好氧反硝化细菌的脱氮特性研究,常用的方法包括:
硝酸盐测定: 在培养基中加入硝酸盐,测定在不同时间内细菌的反硝化速率。
氮气测定: 在培养基中加入硝酸盐,测定在不同时间内氮气的的产生量。
基因表达分析: 利用分子生物学技术,如转录组学(如RNA-seq)和蛋白组学(如质谱分析)等,对好氧反硝化细菌的基因表达进行分析,以了解细菌在反硝化过程中哪些基因的表达量发生了变化。
酶活性测定: 测定好氧反硝化细菌中关键酶(如反硝化酶)的活性,以了解细菌在反硝化过程中酶的作用。
通过这些方法,可以对好氧反硝化细菌进行准确的鉴定,并了解其在脱氮过程中的生物学特性。
一株好氧反硝化细菌的筛选及初步鉴定
2007, Vol. 28, No. 08食品科学※生物工程266的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2005.[6]孟祥成. 双歧杆菌生理功能特性及其应用的研究[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2002.[7]徐营, 李霞, 杨利国. 双歧杆菌的生物学特性及对人体的生理功能[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6): 94-96.[8]MEEI Y L, FEN J C. Antioxidative effect of intestinal bacteriaBifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATTCC 4356[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2000, 45(8): 1617-1622.[9]MEEI Y L, YEN C L. Antioxidative ability of lactic acid bacteria[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47: 1406-1466.[10]KULLISAAR T, ZILMER M, MIKELSAAR M, et al. Two antioxidative lactobacilli strains as promising proboscis[J]. J Food Microbiol, 2002,72: 215-224.[11]MARGOLLES A, GARCIA L, SANCHEZ B, et al. Characterization of a Bifidobacterium strain with acquired resistance to choate-a pre-liminary study[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003,82(2): 191-198.[12]LI X M, LI X L, ZHOU A G. Evaluation of antioxidant activity of thepolysaccharides extracted from Lycium barbarum fruits in vitro [J]. Euro-pean Polymer Journal, 2007, 43: 488-497.[13]ZHAO L, ZHAO G, HUI B, et al. Effect of selenium on increasing the antioxidant activity of protein extracts from a selenium-enriched mush-room species of the ganoderma genus[J]. Journal Food Sci, 2004, 69(3):184-188.[14]贾士芳, 郭兴华, 周志宏, 等. 利用返回式科学卫星选育优良双歧杆菌[J]. 航天医学与医学工程, 1996, 9(6): 407-411.收稿日期：2007-06-14 *通讯作者基金项目：长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0540)作者简介：黄运红(1979-)，男，讲师，硕士研究生，主要从事环境生物技术研究。
好氧反硝化细菌的筛选及其生长动力学特征的开题报告
好氧反硝化细菌的筛选及其生长动力学特征的开题
报告
一、研究背景及意义
环境污染对人类的生存与发展造成了极大的威胁，其中水污染是目
前最为严重的问题之一。
氮污染是水污染的主要形式之一，而好氧反硝
化细菌具有较高的氮去除效率和适应性，因此成为了当前环境微生物研
究领域的热点之一。
好氧反硝化细菌不仅可以在自然环境中发挥重要作用，还可以被应用于废水处理、土壤修复等工业和生态环境中。
因此，
研究好氧反硝化细菌的筛选及其生长动力学特征，对于推动水环境治理
和减轻环境污染具有重要意义。
二、研究内容
本文拟通过实验室微生物培养技术，筛选出一种有较高氮去除效率
和适应性的好氧反硝化细菌，并对其进行生长动力学特征分析，探究其
生长速率、最适生长温度和pH值等方面的特点。
具体实验步骤如下：
1. 制备好氧反硝化细菌筛选培养基，包括源污泥样品、碳源、氮源、磷酸盐、微量元素等成分。
2. 进行好氧反硝化细菌的筛选，筛选条件包括温度、pH值、碳源浓度、氮源浓度、DO浓度等因素。
3. 对筛选出的好氧反硝化细菌进行生长动力学特征分析，包括生长
速率、最适生长温度、最适pH值等指标。
4. 根据实验结果，进一步探究好氧反硝化细菌生长机理和适应性机制，并探索其广泛应用的前景。
三、预期成果和意义
通过本次实验，预计能够筛选出一种具有较高氮去除效率和适应性的好氧反硝化细菌，并对其生长动力学特征进行分析，为研究好氧反硝化细菌生长机理和适应性机制提供基础数据。
同时，本次研究具有重要的环境保护和资源利用价值，可为水污染治理和工业化废水处理提供一定的参考依据。
筛选好氧反硝化菌的方法[发明专利]
![筛选好氧反硝化菌的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/bb6f4dd8162ded630b1c59eef8c75fbfc77d948d.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1594591A [43]公开日2005年3月16日[21]申请号200410043702.4[22]申请日2004.07.12[21]申请号200410043702.4[71]申请人哈尔滨工业大学地址150001黑龙江省哈尔滨市南岗区西大直街92号[72]发明人马放 周丹丹 任南琪 杨基先 [74]专利代理机构哈尔滨市松花江专利商标事务所代理人单军[51]Int.CI 7C12Q 1/02C12N 1/20权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 2 页[54]发明名称筛选好氧反硝化菌的方法[57]摘要筛选好氧反硝化菌的方法，它涉及一种高效筛选好氧反硝化菌的方法。
本发明按照下述步骤进行：a.采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群；b.将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c.对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d.对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。
本发明好氧反硝化技术的实现，不仅能克服传统生物脱氮技术的弊端，还具有以下优势：(1)能够实现同一反应器内脱氮、除COD；(2)在反馈作用的调节下缩短停留时间；(3)减小曝气量；(4)反硝化过程产生的碱度能够中和硝化过程产生的酸度，减小碱度消耗；(5)有助于实现短程同步硝化反硝化。
200410043702.4权 利 要 求 书第1/2页 1、筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于它按照下述步骤进行：a、好氧反硝化菌富集：采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群；b、细菌分离纯化：将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c、好氧反硝化菌初筛：对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌复筛：对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。
好氧反硝化菌群的筛选及其培养条件的研究
本 文通过 梯 度法 添加 焦化废 水 的培养 基筛 选 、 驯化好 氧反 硝化 菌 ， 比较 单菌 株和 混合 菌群 的生 长情 并
况 和反 硝化 能力 ， 并研 究其 最适 培养 条件 ． 为工 业应 用 获得 抗 性较 强 、 长稳 定 、 硝化 能 力 强 、 生 反 适应 焦 化
文 章 编 号 ：６２２ ７ （０ ０ ０—０ ６０ １ ７ —４ ７２ １ ）２０ ３—５
好 氧 反 硝 化 菌 群 的筛选 及 其培 养 条 件 的研 究
孙 菲 方金 武 蔡 昌凤 ， 文玲 ， ， 赵
（． 徽 工 程 大 学 生 物 化 学 工 程 学 院 ． １安 安徽 芜 湖 ２ １０ ；． 湖 新 兴铸 管 有 限责 任公 司 ． 徽 芜 湖 ２ １ ０ ） ４ ００ ２芜 安 ４ ０ ２
＝２ ％（ ５ 菌液浓度 为（ —３ ×１ ｍＬ ． ２ ） Ｏ个／ ）经过筛选 和条件优化 ， 优势菌群 Ｎ —Ｎ去除率 达到 ９ ％ 的降解 ０ Ｏ
时 间 由 ９ ６ ｈ降到 １ ． ８ｈ 关 键 词 ： 氧 反 硝 化 菌 群 ； 选 ； 养 条 件 ； 化 废 水 好 筛 培 焦 文 献 标识 码 ： Ａ
废 水处 理 的好 氧反硝 化 菌群．
１ 材 料 公 司酚氰 污水 处理 站 （ ／ 淮 Ａ。 Ｏ工 艺） 沉池 活性 污泥． 二
试验 所用 焦化 废水 ： 湖市 新兴 铸管 厂焦 化 废水 生 化 处理 站 经 过气 浮 除 油 除渣 的 焦 化废 水 ， Ｏ 为 芜 Ｃ Ｄ
摘 要 ： 淮北 焦 化 厂 Ａ ／ 污 水 处 理 站 二 沉 池 的活 性 污 泥 中 ， 用 焦 化 废 水 配 制 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 固体 培 养 基 从 ｏ 采
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好氧反硝化细菌的筛选摘要：采集江安河及府河淤泥样本，采用btb培养基与n-（1-萘基）-乙二胺光度法筛选出20株具有反硝化能力的好氧菌株。
选取其中5株反硝化能力较强的dm1、dm2、dm3、dm4和dm5菌株，进行no3--n去除率测定，其48 h no3--n去除率均达到了30%以上。
其中dm1、dm2、dm3和dm5菌株氮去除率依次为43.9%、47.6%、47.9%和51.3%。
对dm5菌株进行生长曲线测定，进行ph值和温度对反硝化速率影响测定，试验结果表明在ph 7.0～7.4，温度20～30 ℃时，dm5菌株反硝化效果较好。
关键词：好氧；反硝化细菌；分离；反硝化效率中图分类号：q936 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）05-1053-04screening of aerobic denitrifying bacteriahe wei，zhang yue-xiao，li yong-hong（college of chemical engineering， sichuan university，chengdu 610225， china）abstract： by using btb medium and n-（1-naphthyl）-ethylenediamine photometry， twenty aerobic strains that were capable of denitrification were isolated from the silt samples of jiang an river and fu river. being more capable，five individuals numbered as dm1， dm2， dm3， dm4 and dm5 of the above strains were selected to determine the nitrateremoval rate. the results of determination of aerobic denitrifying activity showed that the nitrate removal rate of all the five strains was more than 30%. and the nitrate removal rate of dm1，dm2，dm3 and dm5 was 43.9%，47.6%，47.9% and 51.3% respectively. the determination of the dm5 growth curve as well as the influence of the ph value and temperature on denitrification rates showed that when the ph value range for dm5 was 7.0～7.4 and the temperature was between 20 ℃and 30 ℃， the efficience of nitrogen removal was better. key words： aerobic； denitrifying bacteria； screening；nitrate removal rate工业生产中未经处理的含氮废水的排放造成了我国河流、湖泊及海洋氮含量普遍增高，进一步导致湖泊富营养化、海洋赤潮等现象，极大地危害到水生物的生存繁衍以及人类自身的健康。
此外，农用氮肥的使用加大了地下水硝酸盐污染程度，硝酸盐可在一定条件下转化为亚硝酸盐，而亚硝酸盐极易致癌，危害人们生命。
我国地下水合格率仅为30%[1]，因此，探究高效经济的脱氮工艺迫在眉睫。
传统的物化脱氮法包括吹脱法[2]、map沉淀法、膜法、折点加氯法和离子交换法，主要用于高浓度含氮废水处理，而对于低浓度含氮废水而言其成本相对过高，而运用新型生物脱氮法进行低浓度废水处理则优势明显。
现阶段生物脱氮法主要包括活性污泥法[3]、固定化生物脱氮[4]以及微生物制剂[5]等，其理论技术都趋于成熟，然而其前提条件是找到一种反硝化效率较强的菌株。
本研究以江安河和府河淤泥为基础，以硝酸钾为惟一氮源，以梯度划线法和btb平板筛选等方法相结合进行好氧反硝化细菌的筛选，得到反硝化效率较高的菌株，并对所得菌株反硝化能力进行ph 值以及温度影响的评估，以得到菌株最适的反硝化条件，为生物脱氮提供新的菌种选择依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源从江安河和府河采取污泥样本进行菌株筛选以及反硝化性能的研究。
1.1.2 培养基及试剂 lb液体培养基（1 l）：kno3 1.00 g、kh2po4 1.00 g、fecl2·6h2o 0.05 g、cacl2·7h2o 0.02 g、mgso4·7h2o 1.20 g、琥珀酸钠8.60 g，1×105 pa灭菌20 min；btb初筛培养基[6] （1l）：琼脂20.00 g、kno3 1.00 g、kh2po4 1.00 g、fecl2·6h2o0.50 g、cacl2·7h2o 0.20 g、mgso4·7h2o 1.20 g、琥珀酸钠8.50g、溴百里酚蓝（btb）（1%乙醇溶液）1 ml，用1 mol/l的naoh调节ph至7.0～7.3，1×105 pa灭菌20 min；dm反硝化培养基（1 l）：kno3 0.72 g、kh2po4 1.00 g、mgso4·7h2o 1.00 g、琥珀酸钠4.30 g，1×105 pa灭菌20 min；盐酸n-（1-萘基）-乙二胺光度法[7]所用试剂：盐酸溶液和对氨基苯磺酸溶液；紫外分光光度法[8]所用试剂：盐酸溶液和氨基磺酸铵溶液。
1.2 方法1.2.1 细菌富集取适量江安河和府河淤泥分别加入盛有50 ml lb液体培养基的250 ml三角瓶中，在温度为30 ℃、摇床转速为180 r/min的条件下培养48 h。
1.2.2 细菌初筛吸取适量富集后的培养液，分别进行104、105、106及107倍稀释。
用移液器分别吸取稀释后的培养液0.1 ml均匀涂布于btb固体培养基上，在温度为30 ℃的条件下培养48 h。
由于反硝化过程中no3-还原会使培养基的ph值升高，试验中所用的选择性培养基（btb初筛培养基）所含的产碱指示剂溴百里酚蓝能够准确地指示这一变化，而显现出蓝色，因此选取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落作为初筛菌株。
1.2.3 细菌复筛将上述初筛得到的菌株，用接种环在无菌条件下接种到盛有50 ml dm反硝化液体培养基的250 ml的三角瓶中，在温度为30 ℃、摇床速率为180 r/min的条件下培养48 h。
再将培养后的菌株接种到新鲜的dm反硝化液体培养基中，在同样条件下培养48 h。
重复上述步骤4次，可基本得到纯化菌株。
利用盐酸n-（1-萘基）-乙二胺光度法检测培养液中是否有no2-产生。
选取变红的细菌培养液进行no3-含量测定，得到能使no3-明显降低的菌株作为复筛菌株。
将复筛后得到的菌株接种于dm反硝化斜面，保存于4 ℃冰箱中。
1.2.4 好氧反硝化细菌反硝化速率测定菌悬液的制备：从斜面中，用接种环接一环细菌于装有20 ml dm反硝化培养基的100 ml 三角瓶中，在温度为25 ℃、摇床转速为160 r/min条件下培养16h后，保存于4 ℃冰箱。
在盛有20 ml新鲜dm培养基的100 ml三角瓶中接入0.5 ml上述菌悬液，在温度为25 ℃、摇床转速为160 r/min条件下培养。
以未接种菌株的dm液体培养基作为对照，每隔24 h测定no3-浓度，连续检测48 h。
检测方法为紫外分光光度法，所用仪器为北京普析通用仪器有限责任公司生产的tu-1810紫外分光光度计。
以上试验均设置2个平行样，最终数据取平均值。
1.2.5 好氧反硝化细菌生长曲线测定移取1 ml细菌菌悬液于盛有100 ml新鲜dm培养基的500 ml三角瓶中，在温度为25 ℃，摇床转速为160 r/min的条件下培养。
以未接种菌株的dm培养基作为对照，培养6 h后，每隔4 h取一次样。
用tu-1810紫外分光光度计于波长540 nm处测定其光密度值。
利用细菌浓度与光密度值成正比的关系，绘制光密度值和时间的关系曲线，即为细菌生长曲线。
1.2.6 ph对好氧反硝化细菌反硝化效率的影响测定分别移取0.5 ml细菌菌悬液接种于ph为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0及11.0盛有50 ml新鲜dm培养基的250 ml三角瓶中，在温度为25 ℃、摇床速率为160 r/min的条件下振荡培养48 h后，用紫外分光光度法检测培养液中no3--n浓度。
1.2.7 温度对好氧反硝化细菌反硝化效率的影响测定将细菌菌悬液以0.5 ml的含量接种于盛有50 ml新鲜dm反硝化培养基的的250 ml三角瓶中，分别在温度为15、20、25、30及45 ℃条件下培养。
48 h后，用紫外分光光度法检测培养液中no3--n浓度。
2 结果与讨论2.1 好氧反硝化细菌筛选结果从江安河和府河淤泥中初筛得到能使btb培养基变蓝的菌株30株，且均是从稀释106倍的涂布平板得到，其中江安河淤泥中筛选得到菌株18株，府河淤泥中筛选得到菌株12株。
为保证菌株的单一性，之后对上述试验得到的菌株进行了5次dm液体培养基纯化。
复筛时，培养液中分别滴加对氨基苯磺酸溶液和盐酸n-（1-萘基）-乙二胺溶液，培养液能变红的细菌菌株共20株。
其原理在于反硝化过程中会生成亚硝酸盐，而亚硝酸盐与对氨基苯磺酸生成重氮盐，再与n-（1-萘基）-乙二胺偶联生成红色染料。
因此这也证明了这20株菌在好氧情况下能够进行反硝化过程的第一步，确实是我们需要筛选得到的细菌。
为了进一步明确菌株的反硝化作用效果，试验利用紫外分光光度法测量no3--n浓度，得到能使其明显降低的细菌菌株16株，筛选得到降解硝酸盐能力较强的细菌菌株5株，编号分别为dm1、dm2、dm3、dm4及dm5。
试验发现反硝化能力较强的5株好氧反硝化细菌均筛选自江安河的淤泥中，并且在dm反硝化液体培养基中培养时发现培养液均会变为绿色粘稠状，但颜色程度有所不同（图1），上述结果与李永勇等[9]的研究结果相似。
2.2 好氧反硝化细菌dm5的形态特征将筛选得到的dm5菌株在平板上划线，于25 ℃的恒温培养箱中培养48 h，其结果如图2所示，菌株呈乳黄色，光滑湿润，易挑取。