Bt伴胞晶体毒蛋白的结构、功能和应用

1.2毒素蛋白的分类
鉴于这一分类系统在同源性和杀虫谱之存在冲突， 1995 年,在国际无脊椎病理学会年会上成立的由N. Crickmore 等组成的杀虫晶体蛋白基因命名委员会提出只 根据氨基酸序列的同源性进行分类。
这个系统利用计算机比较晶体蛋白氨基酸序列的同 源性，以45%、78%和95%为界，将基因划分为四个分类等 级，依次用阿拉伯数字、大写英文字母、小写英文字母和 阿拉伯数字表示 。
2.4 三个结构域之间的相互作用
研究显示,Bt 毒素的不同结构域在一定程度上互相 作用,互相影响。常用的研究方法是对某结构域进行突变。 例如,结构域Ⅰ的突变影响与受体的结合,结构域Ⅱ的突变 能在不影响与受体结合的情况下影响其毒力,Cry3A 的结 构域Ⅱ上环3 发生突变降低了亲和力却增加了毒性,结构 域Ⅲ的一段保守区域发生突变能影响毒力和孔道形成。 同时,还可以通过交换各个毒素蛋白的各个结构域的 编码区，表达杂合蛋白基因，分析杂合毒素蛋白的功能， 从而阐明毒素结构域之间的相互作用。
α-外毒素β外毒素γ-外 毒素不稳 定外毒素
水溶性毒 素鼠因子 外毒素
Bt是世界上目前应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂, 也是公认的无公害生物农药，其优点很明显： 1.对病虫害防治效果好 2.对人畜安全无毒 3.环境风险性低 4.能保持生态平衡 5.不杀死害虫的天敌和益虫 6.生产原料和有效成分属于天然产物 目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt己 成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程 植物重要的基因来源。而且随着研究的深入，研究者们又 分离到了其对癌细胞有特异的毒杀作用而对正常细胞则无 毒杀作用的菌株 ，进一步拓展了苏云金芽胞杆菌杀虫晶 体蛋白的生物活性谱和生物学功能。
Bacillus thuringiensis (Bt)
Sporulated culture
Crystal
1901年，日本学者石渡首次从染病的家蚕中分 离出该菌，并证明它对部分鳞翅目昆虫有杀虫活性。 1915年，Berliner再次发现并依其发明地点德国苏 云金省而定名 ，于1938年在法国正式成为商品。
位于C端，是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心 结构，以“果酱卷” （Jelly roll）拓扑结构排列。其 功能目前了解较少。 有人推测其可能能够防止蛋白酶对 晶体蛋白分子的过度降解，稳定晶体蛋白整体结构，决定 杀虫晶体蛋白专一性。有证据显示其与维持蛋白结构的稳 定性、通过与结构域Ⅰ接触调节离子通道的电流以及特异 受体的识别和结合有关。
总之，晶体蛋白毒素与昆虫中肠细胞上的专一性受 体蛋白相互作用,并在细胞膜上形成孔道这一过程,是毒性 多肽的各个结构域共同完成的，不同结构域起着不同的作 用。
但是由于毒性多肽与受体蛋白的结合并不是简单的 一一识别作用,还表现出多样性和复杂性。因此很难对毒 性多肽结构域的功能作单一的描述。
3.毒素蛋白与昆虫的作用机理
2.1.2 “伞状模型” ：
Li等人根据ICPs可能所共有的三维空间结构提出了 “伞模型”。依照这个模型，α6和α7螺旋或α4和α5螺 旋形成一个发夹结构，处在结构域Ｉ的边沿，最接近于质 膜。当其它的螺旋在膜表面象伞架打开时，这一对螺旋将 比较容易插入脂双层膜，如图：
伞状模型
2.1.3 “α5螺旋六聚体”模型：
随着人们认识的加深，现已证实，苏云金芽胞 杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、直翅目、 食毛目等10个目的500多种昆虫以及原生动物门、线 形动物门、扁形动物门、疟原虫、血吸虫、瞒类等 有不同程度的杀虫活性。
CryⅠ
CryⅡ
CryⅢ δ-内 毒素 苏云金 芽胞杆 菌能产 生7种毒 素蛋白 CryⅣ CryⅤ-Ⅵ Cyt
2.2 结构域Ⅱ：
位于肽链的中间，为三组以“希腊钥匙”（Greek key）拓扑结构连接在一起的反平行的β折叠片层，具顶 端突环，该凸环在不同的毒素中，其长度和氨基酸序列不 同，参与了毒蛋白与受体蛋白的结合，决定着毒素作用于 昆虫的特异性。结构域Ⅱ是最容易在长度和氨基酸序列上 发生变化的区域。
2.3 结构域Ⅲ：
大部分的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因各编码含一 个60kD左右的胰蛋白酶抗性中心，分子量为130-160kD的蛋 白。晶体蛋白中杀虫活性部分位于晶体蛋白N-末端的胰蛋白 酶抗性中心, 而C-末端对于维持蛋白的晶状结构具有非常重 要的作用。
目前已通过多对同晶置换法X-衍射晶体图谱确定了一些 晶体蛋白的三维结构，本研究室利用同源建模的方法获得了 Cry5Ba的理论三维模型。与确定三维结构的晶体毒素进行比 较，发现它们的三维结构很相似，都是由三个典型的结构域 组成拓扑学结构。
毒素与受体作用机理模式图
3.2 毒素蛋白受体：
关于受体的研究近年来取得了很大的发展，已知在 不同的昆虫体内有不同的受体结合蛋白，其中主要是一些 120-180kD的糖蛋白，此外，还有一些非糖蛋白的受体结 合蛋白，目前已经发现的昆虫中肠Bt毒素受体结合蛋白主 要包括氨肽酶（APN）和类钙粘蛋白家族，碱性磷酸酶、 多种糖脂、肌动蛋白等也被证明是昆虫中肠Bt毒素受体结 合蛋白。
Pymol预测蛋白质表面相对静电荷
2.毒素蛋白的结构和功能
Molsoft预测cry蛋白活性位点
2.毒素蛋白的结构和功能
2.1 结构域Ⅰ：
结构域Ⅰ位于肽链的N 端,是一组由6-7个两亲的α螺 旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α 螺旋束，参与了细 胞膜的穿孔。人们利用蛋白质及脂膜相互作用的生物化学 原理，通过对多个毒素蛋白三维结构比较和功能分析，并 提出了如下模型：
3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 在这一模式中，Bt-R1和GPI锚定蛋白是重要参与者。 CryA原毒素进入中肠被活化后与受体Bt-R1结合，这有利于毒 素N端裂解消除α-1螺旋，形成毒素聚合体，然后聚合体与第 二受体APN结合，使之插入细胞膜脂质筏，形成孔道。另一 GPI锚定蛋白受体ALP（Alkaline phosphatase）也能协助聚 合体插入脂质筏。如图：
1.1毒素蛋白的基本特征
B.thuringiensis YBT-1518
B.thuringiensis M15 球 形 晶 体
米粒状晶体
菱 形 晶 体
1.2毒素蛋白的分类
1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列 和杀虫谱的不同，将已经发表的42种晶体蛋白分为5群14 亚类。
Βιβλιοθήκη Baidu
2.毒素蛋白的结构和功能
对Cry毒素结构和功能的的研究离不开一些常用的生物 信息学软件，例如Swiss-PdbViewer， Pymol 。
Cry5Ba
Cry1Aa
2.毒素蛋白的结构和功能
I III
II
Swiss-PdbViewer显示Cry蛋白三维模型
Pymol显示Cry蛋白三维模型
2.毒素蛋白的结构和功能
近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原 先分类系统中的氨基酸序列与杀虫活性间产生了不协调性， 而且随着新基因的发现，这种分类方法越来越不能满足这 两个条件，使得分类难以确定。
截止2007年4月2日,这些基因按其核苷酸序列的同源 性已被分为cry1-cry51、cyt1、 cyt2共53类, 396种, cry基因372种,cyt基因24种 。
Gazit等分析了α5螺旋片段提出了一个新的修饰模 型。作为“伞状模型”的补充， “α5螺旋六聚体”模型 认为，由于α5螺旋在所有的ICPs中都是高度保守的，而 且在体外它能够在平面脂双层膜上形成孔道，因此认为 α5螺旋可通过一个六聚体形式，即α5螺旋的亲水侧向内， 亲脂侧向外组成一个亲水离子通道，镶嵌在脂双层中间形 成离子通道。
但是目前也已有多种昆虫对Bt毒素产生了不同程度的 抗性，一些昆虫甚至还能在转Bt基因植物上完成整个生活 史。昆虫对Bt的抗性已成为阻碍Bt生物杀虫剂的持续使用 和转Bt基因植物广泛种植的潜在危险。
我们只有继续深入研究Bt晶体毒素蛋白的结构功能和 与受体的相互作用，才能逐步揭示昆虫产生复杂抗性机制 的原因,才能更好更有效的利用这一机理构建高效、广谱 的生物杀虫剂，利用这一宝贵的生物自然资源，显示苏云 金芽胞杆菌更广阔的应用前景，可见对于Bt毒蛋白的研究 具有重要的理论意义和经济价值。
1.3毒素蛋白在Bt中的分布
现在发现的116个杀虫蛋白基因，分别分布于Bt不同 菌株中。不同血清型、不同亚种之间，其基因数和种类有 明显差异。同一菌株的杀虫晶体蛋白基因，也可能定位于 不同的质粒上；或者多个晶体蛋白基因定位于同一质粒上； 而有的则定位于染色体上，或同时存在于质粒和染色体上。
2.毒素蛋白的结构和功能
3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 最近又有研究者提出了一种信号传导模式，即蛋白与 受体的结合激活了G蛋白和腺嘌呤环化酶，提高了cAMP水 平，激活了蛋白激酶A，从而导致昆虫致死 。此外，还有 研究者提出，除了Cry毒素破坏昆虫中肠细胞外，还有其 他的中肠细菌使昆虫产生败血症。 在第一种模式中，形成毒素聚合体是细胞死亡的关键 因素，而在第二种模式认为，只有Cry毒素单体与Bt-R1结 合后毒素才能产生毒性作用，而与APN和ALP结合并非Cry 毒素产生毒性的重要因素。 前两种作用模式中，毒素蛋白与昆虫受体的结合都是 决定其杀虫活性的一个关键步骤 ，因此深入研究毒素蛋 白与受体相互作用对探讨毒蛋白功能和杀虫机理具有非常 重要的作用。
Bt伴胞晶体毒蛋白的结 构、功能和应用
丁学知 教授
湖南师范大学 生命科学学院 微生物分子生物学省部共建国家重点实验室培育基地
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌（G+）,其 突出特征是在芽孢内可产生菱形或方形的伴胞晶 体(Parasoral crystal), 被称为δ-内毒素,或杀 虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Protein , ICP), ICP是由cry基因和cyt基因编码的。
其中具有溶血溶细胞作用的27kDa晶体蛋白基因被命 名为cyt基因，其他只有杀虫活性的13亚类命名cry基因。 cry基因可划分四群，即cryI 为鳞翅目特异性，cryⅡ为 鳞翅目和双翅目特异性，cry Ⅲ为鞘翅目特异性，cryIV 双翅目特异性。
1.2毒素蛋白的分类
由于当时发现的基因数目少，彼此之间有明显的差异， 因此各个基因的分类地位比较明确，从而使得Hofte和 Whiteley的分类系统被广泛的接受和采用。
2.1.1“铅笔刀”模型： 该模型由Hodgman提出。该模型被认为α5螺旋和α6 螺旋最可能是孔形成的结构单位，这是完全基于亲水脂螺 旋的疏水表面积来推测的。α5螺旋和α6螺旋连在结构域 Ｉ的端点，离膜最远。因此，在作用于膜时，这两个螺旋 必须象打开的铅笔刀一样从结构域Ｉ中伸出，插入脂双层 膜。这样一个模型不需要结构域Ｉ中其它α螺旋的重排， 一个亲水离子通道将由多个毒素分子寡聚体通过相同的作 用方式排成一个圆而形成，如图：
3.1毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 虽然Cry毒素是一种应用很广泛的杀虫剂，但其作用 机制至今还没被了解透彻。目前普遍认为 Bt毒素蛋白通 过与受体结合而在昆虫中肠细胞形成孔道，插入膜并最终 导致昆虫死亡，其作用模式是： ①晶体被靶标昆虫吞食后在昆虫的碱性中肠中溶解成原毒 素； ②中肠中存在的蛋白酶对原毒素进行消化，并释放出活性 多肽； ③活性多肽与中肠膜受体结合； ④活性多肽插入中肠细胞表皮膜形成离子通道或孔道，使 中肠肠道细胞的渗透平衡遭到破坏，导致昆虫发生肿胀、 厌食而死亡 。
本实验室主要研究内容：


毒素蛋白的基本特征和分类 毒素蛋白的结构和功能 毒素蛋白和异源基因的克隆以及工程菌的 构建 毒素蛋白与昆虫的作用机制 苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究
1.毒素蛋白的基本特征和分类
1.1毒素蛋白的基本特征
编码杀虫晶体蛋白的基因在苏云金芽胞杆菌表达产生的Bt杀虫晶 体蛋白，以一种前体的形式存在于菌体内，称为原毒素(Protoxin)， 能自发形成伴胞晶体。晶体的形成可能在一定程度上防止了杀虫蛋白 在环境中的降解。不同种类的杀虫晶体蛋白可以存在于同一块伴胞晶 体中。这些伴胞晶体通常有一定的几何形状，一般规律是Cry1类型形 成双锥形的晶体；Cry2类型一般形成立方型的晶体；Cry3基本上形成 菱形的晶体；其他种类的杀虫蛋白还可形成其他的晶体形状，如卵形、 等。