蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质提纯的一般方法
蛋白质提纯的一般方法1.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点。
在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。
2.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。
由此可以用凝胶过滤法，超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。
3.根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。
在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。
盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法4根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。
蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。
对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。
主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。
5.根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。
这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。
6根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质逆流分配色谱7.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。
蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质8根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。
蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质的分离纯化方法一
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
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范树国
4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
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范树国
普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
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范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
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范树国
（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质的分离提纯是研究蛋白质结构和功能的重要步骤。
它可以帮助
研究人员去除与蛋白质混合的其他成分，从而获得纯净的蛋白质样品。
蛋
白质分离提纯的一般原则包括选择合适的分离技术、优化分离条件、多步
分离和分析样品纯度。
第一步是选择合适的分离技术。
目前常见的蛋白质分离技术包括电泳、层析、离心等。
不同的分离技术有其独特的特点和适用范围，因此选择适
合自己实验需要的技术非常重要。
第二步是优化分离条件。
在进行蛋白质分离时，需要优化一系列条件，如缓冲溶液pH值、离子强度、温度和时间等。
优化分离条件有助于提高
分离效果，提高蛋白质的回收率和纯度。
第三步是多步分离。
通常情况下，蛋白质分离提纯需要进行多步分离。
第一步是粗提，通过快速分离蛋白质样品和其他成分，去除杂质。
第二步
是精提，通过使用更精细的分离技术和条件，进一步提高蛋白质样品的纯
度和回收率。
多步分离可以逐步去除杂质，从而得到纯净的蛋白质样品。
第四步是分析样品纯度。
在分离提纯过程中，需要经常对样品的纯度
进行检测。
常用的方法有SDS-凝胶电泳和Western blot等。
通过分析样
品的纯度，可以确定分离提纯过程中是否需要调整分离条件，以提高纯度。
总结起来，蛋白质分离提纯的一般原则包括选择合适的分离技术、优
化分离条件、多步分离和分析样品纯度。
通过遵循这些原则，可以获得高
纯度的蛋白质样品，为后续的分析和应用奠定基础。
蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质分离提纯的一般原则1.前处理把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来,保持原来的天然状态,并不丢失生物活性;常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等;超声波破碎法：当声波达到一定频率时,使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术;超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压,这个低气压使液体转化为气体,即形成很多小气泡;由于局部压力的转换,压力重新升高,气泡崩溃;崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中,形成剪切力使细胞破碎;2．粗分级分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法;这些方法的特点是简便、处理量大,3．细分级样品的进一步纯化;样品经粗分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去;进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等;必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤;结晶是最后的一步分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；5.对配体分子的生物亲和力等;一根据分子大小不同的纯化方法1.透析利用蛋白质分子不能通过半透膜,使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开;2.密度梯度离心;蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小,而且也取决于它的密度;3.凝胶过滤利用蛋白质分子大小,因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠,其内部是多孔的网状结构;当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外,比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外,由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离;大分子先被洗脱下来;小分子后被洗脱二利用溶解度差别的纯化方法1．等电点沉淀和PH的控制蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀;因此在其他条件相同时,它的溶解度达到最底点,利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法;2. 蛋白质的盐溶和盐析中性盐可以增加蛋白质的溶解度,这种现象称为盐溶;盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质分子与水相互作用加强了,因而溶解度增加当溶液的离子强度增加到一定数值时,蛋白质的溶解度开始下降;当离子强度足够高时,很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析;盐析作用的主要原因是大量中性盐的加入使水的活性降低,原来溶液的大部分甚至全部的自由基水转变成盐离子的水化水。
生物化学实验-蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
小
结
粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级 等方法；
细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换 层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可 采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步 骤。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
蛋白质分离纯化
凝胶层析
原理：
1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗 脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子 物质迁移速度快；
注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
离子交换层析
可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；
蛋白质分子量的测定
最小分子量测定法 如Mb含Fe为0.335%，则
M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。
其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe 的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法 测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的基本流程选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩浓缩、、干燥和保存一、材料的选择和预处理微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和脂肪组织。
对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
二、细胞的破碎（一）机械方法机械方法：：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
高速组织捣碎机高速组织捣碎机（（转速可达10000rpm ，具高速转动的锋利的刀片的刀片），），），适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎。
玻璃匀浆器玻璃匀浆器（（用两个磨砂面相互摩擦用两个磨砂面相互摩擦，，将细胞磨碎将细胞磨碎），），），适适用于少量材料用于少量材料；；也可用不锈钢或硬质塑料等也可用不锈钢或硬质塑料等，，两面间隔只有十分之几毫米有十分之几毫米，，对细胞破碎程度比高速捣碎机高对细胞破碎程度比高速捣碎机高，，机械切力对分子破坏较小切力对分子破坏较小。
小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细石英砂及玻璃粉磨细。
（二）物理方法物理方法：：主要通过各种物理因素的作用主要通过各种物理因素的作用，，使组织细胞破碎。
反复冻融法反复冻融法：：将细胞在-20度以下冰冻度以下冰冻，，室温融解室温融解，，反复几次几次，，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀起溶胀，，使细胞结构破碎使细胞结构破碎。
超声波法超声波法：：用一定功率的超声波处理细胞悬液用一定功率的超声波处理细胞悬液，，使细胞急剧震荡破裂剧震荡破裂，，此法多适用于微生物材料此法多适用于微生物材料；；只要有设备只要有设备，，该法方便且效果也好法方便且效果也好，，但一次处理量较小但一次处理量较小。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
第七章_蛋白质分分离纯化和表征09
（三）根据电荷不同的纯化方法
电泳 :在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的 电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为： 自由界面电泳 区带电泳 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜） 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉末与适当溶剂调 和，铺板） 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是一类微量电 泳 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖 凝胶
几种蛋白质等电点
二、蛋白质的分子大小与分子量的测定
蛋白质的分子量的范围:
6×103～1×106 Da
测定蛋白质相对分子量的原理和方法
（一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的 含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原 子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。 例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%, 计算二者的相对分子质量。
溶剂的密度(g/cm3)
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离 的技术，同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关: 先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
① 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→ 蛋白质脱去水 化层。 优点：不引起蛋白质变性。
盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。
② 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）→脱去水化层以及 降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。 条件：低温操作，缩短时间。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
蛋白质理化性能与纯化
不可逆沉淀
蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收； 蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。
蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应(ninhydrin reaction) 。
离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC)； 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析(molecular sieve filtration)或体积排阻色谱（ steric exclusion chromatography）； 疏水相互作用色谱（ Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）； 亲和色谱（Affinity Chromatography，AFC)。
将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
免疫沉淀法（immunoprecipitation)
利用荷电性质可将蛋白质采用
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。
离心机和离心沉降法分离蛋白质
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基
把肽链水解成片段，分别进行分析
测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法
一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。
蛋白质提纯注意事项
蛋白质提纯注意事项
蛋白质提纯的注意事项包括以下几点：
1. 操作应尽可能在冰上或冷库内进行，以防止蛋白质的变性。
2. 维持合适的pH，除非进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH应避免与pI相同，以防止蛋白质的沉淀。
3. 使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解。
在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。
4. 避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。
5. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。
6. 在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。
7. 加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。
8. 使用灭菌溶液，防止微生物生长。
9. 在前处理阶段，需要将蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。
如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。
注意，这只是蛋白质提纯的部分注意事项，具体的操作流程和实验条件可能需要结合实验需求和实际情况进行调整。
生物化学研究进展论文蛋白质提纯
生物化学研究进展论文蛋白质提纯文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-生物化学研究进展作业题目蛋白质的提取、纯化姓名学号班级专业题目：蛋白质的提取、纯化姓名：专业：摘要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。
关键词：提取原理提取方法水溶液有机溶剂双水相萃纯化意义基本原则方法溶解度带电性质电荷数配体特异性前景正文：1 蛋白质样品的提取1．1蛋白质样品的提取原理提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。
1．2 蛋白质样品的提取方法1．2．1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。
通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃以下)下操作。
另外，蛋白质和酶是两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。
一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。
此外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。
因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。
1．2．2 有机溶剂提取法一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的密度差大，便于离心分离。
但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。
许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。
到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。
且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。
蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。
因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。
其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。
对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。
同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。
另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。
有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。
分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。
操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。
有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。
一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。
其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。
某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。
在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。
根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。
因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。
分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。
它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
蛋白质分离技术1
• 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
+
带正电荷蛋白质 （疏水胶体）
带负电荷蛋白质 （疏水胶体） 蛋白质聚集沉淀
⑵ 中性盐的选择
• 常用的中性盐中最重要的是 (NH4 ) 2SO4，因 为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： • 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高 的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于 酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而 盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度， 远远高于其它盐类：
（三）分离纯化的一般程序
生物大分子的分离纯化一般可分为 以下几个阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进 行细胞器的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细 分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离 纯化的前处理。
选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定
二、 蛋白质（酶） 分离纯化的前处理
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
（三）细胞器的分离
• 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。 • 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 • 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在 适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次 分步离心后，即可获得所需组分。
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蛋白质分离提纯的一般原则
1.前处理
把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢
失生物活性。
常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。
超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。
超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体
，即形成很多小气泡。
由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。
崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。
2．粗分级
分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
这些方法的特点是简便、处理量大，
3．细分级
样品的进一步纯化。
样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。
进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。
必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。
结晶是最后的一步
分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；
5.对配体分子的生物亲和力等。
(一)根据分子大小不同的纯化方法
1.透析
利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。
2.密度梯度离心。
蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。
3.凝胶过滤
利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。
当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。
大分子先被洗脱下来。
小分子后被洗脱
(二)利用溶解度差别的纯化方法
1．等电点沉淀和PH的控制
蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没
有静电斥力而聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最底点，利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。
2. 蛋白质的盐溶和盐析
中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。
盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水相互作用加强了，因而溶解度增加
当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。
当离子强度足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用的主要原因是大量中性盐的加入使水的活性降低，原来溶液的大部分甚至全部的自由基水转变成盐离子的水化水。