生物制药工艺学实验

生物制药工艺学实验指导

（12个实验，36学时）

焦飞

生物技术教研室

实验一健胃消食片配方及片剂的制备

一、实验目的

1.掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素；

2.学会片剂处方的调配。

二、实验材料和仪器

太子参，陈皮，山药，麦芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂酸镁，粉碎机，干燥箱，制片机

三、实验原理

健胃消食片为内科伤食类非处方药品，主治健胃消食，用于脾胃虚弱，消化不良，脾胃虚弱所致的食积，症见不思饮食，暖腐酸臭，脘腹胀痛。健胃消食片的配方如下，太子参228.6g，陈皮22.9g，山药171.4g，麦芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精适量，值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片，气略香，味微甜，酸。制作方法：太子参半量与山药粉碎成细粉，其余陈皮三味药及剩余的太子参置于烧杯，加3倍量水，煎煮1小时，滤过，合并两次煎液，减压浓缩至浸膏，干燥。将蔗糖粉糊精和生药粉以3：1：1的混合粉与浸膏混合制成软材，软材的软硬应适当，以“手握成团，轻压则散”为宜。采用挤出制粒的方法制成颗粒，颗粒在60-80摄氏度干燥，干燥时应逐渐升温，以免因颗粒表面干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。颗粒整粒后加入1％硬脂酸镁混合后压片。

四、实验步骤

1.称取太子参2

2.8g，陈皮2.3g，山药17.1g，山药17.1g，麦芽17.1g，山楂11.4g

2.太子参山药用粉碎机粉成细粉。

3.将上述药材放入烧杯中，加入3倍量的水，煎煮半小时，重复两次，将上清液合并，减

压浓缩至浸膏，将所得浸膏放入烘箱中80度干燥。

4.将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成颗粒软材，将软材放入烘箱中

逐渐升温干燥。

5.干燥后的软材加入1％硬脂酸镁放入压片机中压片。

实验二溶菌酶结晶的制备

一、实验目的

1.掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程；

2.学会溶菌酶的结晶和精制方法。

二、实验材料与仪器

新鲜鸡蛋，氯化钠，1 mol/L 氢氧化钠溶液，醋酸缓冲液，烧杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。

三、实验原理

溶菌酶又称细胞壁质酶或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧销的生化物质，广泛应用于医学临床。具有多种药理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌的作用，常用于五官科多种粘膜炎症，皮肤带状疮疹等疾病。是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。

四、实验步骤

（1）收集鸡蛋清将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（最好是新生的鸡蛋、PH 值不得低于8，否则不能使用），按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5min，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快、搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。

（2）加入氯化钠按每100ml蛋清溶液加入2g.氯化钠的比例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。

（3）粗制溶菌酶加完氯化钠细粉后，再用1mol/L 的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的PH值调节到10.8。在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液PH值时，用胶头滴管将其逐渐滴入并不断搅拌以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量。为加速溶菌酶的结晶过程，可再加入适量的溶菌酶结晶体作为晶种。低温下静置数天，溶菌酶结晶将慢慢析出，于72~96h 达到最高产率。待结晶完全后，倾去上清液并用布氏漏斗滤出结晶，即可得到粗制的溶菌酶晶体。

（4）精制溶菌酶将制得的粗结晶用PH值4.6的醋酸溶解，然后让酶液静置2h，接着过滤除去不溶物，收集滤液并量出体积，按100ml滤液加5g氯化钠的比例加入（加入方法与第二步加入氯化钠的方法相同）。然后用1mol/L的氢氧化钠溶液缓慢地将其PH值调节到10.8 后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用布氏漏斗过滤可得溶菌酶结晶，如纯度不够，可重复操作提纯，直至达到所需要的纯度为止，结晶于30~40°:烘干后即得溶菌酶产品。

（5）包装存贮产品应装于玻璃或陶瓷容器中，置于阴冷处保存，以免溶菌酶受热后失去活性。

注意事项

（1）整个过程只能在玻璃或陶瓷容器中进行，不可用金属容器，以免酶失活而影响产品的得率及质量。

（2）操作的全过程要在低温下进行（10°以下），防止原料变质和酶失活。

（3）第三步中加入溶菌酶晶种的具体操作是将溶菌酶晶体均匀地悬浮于少量的PH值为10.8，浓度为5%氯化钠溶液中，取几滴加入到调好的PH值和氯化钠浓度的蛋清液内，再置低温处结晶。

实验三纤维素酶活力的测定

一、实验目的

1.了解纤维素酶的种类和测定原理，以及纤维素酶的作用特性；

2.掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法。

二、实验原理

纤维素酶是一种多组分酶，包括4种组分：内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶（又称β-葡聚糖苷酶）。在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖等还原糖。这些还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540 nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。

由不同底物测得的酶活力分别称为FPA（滤纸糖酶活力）和CMCA（羧甲基纤维素酶活力）。为了统一标准，目前通常用滤纸作为纤维素酶作用的底物。

纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)指lg 固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。